陳林波 洪芬芬 許豐

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第3位，女性中排到第2位[1]。2012年，全球范圍內(nèi)約有140萬新發(fā)結(jié)直腸癌病例，并且有近70萬例死于結(jié)直腸癌[1]。因此，對結(jié)直腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療至關(guān)重要。正常結(jié)直腸黏膜-結(jié)直腸腺瘤-結(jié)直腸腺癌被認(rèn)為是結(jié)直腸腺癌形成的經(jīng)典途徑[2]，可見作為結(jié)直腸腺癌的上游環(huán)節(jié)，了解結(jié)直腸腺瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制并進(jìn)行深入研究有助于結(jié)直腸腺癌的早期診治。高通量芯片技術(shù)的快速發(fā)展為人類研究疾病基因表達(dá)譜與分子機(jī)制提供了巨大幫助[3]，如對結(jié)直腸腺癌及配對癌旁組織行芯片分析可篩選出結(jié)直腸腺癌相關(guān)基因及關(guān)鍵信號通路[4]，但目前對結(jié)直腸腺瘤的相關(guān)研究報道少見。本研究從基因芯片公共數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus（GEO）下載結(jié)直腸腺瘤基因芯片，采用生物信息學(xué)技術(shù)對其分析后篩選出結(jié)直腸腺瘤與正常結(jié)直腸黏膜的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes,DEGs），之后對DEGs進(jìn)行功能注釋，同時構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵基因，以期為尋找結(jié)直腸腺瘤和腺癌的早期診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）公共數(shù)據(jù)平臺GEO數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸腺瘤基因芯片數(shù)據(jù) GSE8671，芯片平臺是 GPL570（HG-U133_Plus_2，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）。該芯片包含32例結(jié)直腸腺瘤組織和32例正常結(jié)直腸黏膜組織的基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)。

1.2 DEGs篩選 應(yīng)用R語言軟件limma包[5]對GEO數(shù)據(jù)庫下載的結(jié)直腸腺瘤基因表達(dá)矩陣進(jìn)行差異分析，篩選出結(jié)直腸腺瘤與正常結(jié)直腸黏膜組織的DEGs。篩選標(biāo)準(zhǔn)：log2基因表達(dá)差異倍數(shù)（foldchange，F(xiàn)C）絕對值≥2，P＜0.05。

1.3 DEGs的基因本體論（gene ontology,GO）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes）分析 應(yīng)用生物信息學(xué)在線分析工具DAVID（https∶//david.ncifcrf.gov/）[6]對DEGs的GO及KEGG分析，得到DEGs功能富集分析和信號通路分析數(shù)據(jù)。校正P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 利用Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes （STRING,https∶//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫[7]分析結(jié)直腸腺瘤DEGs間的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，combined score＞0.4視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件[8]，找出網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白，得出關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果 在結(jié)直腸腺瘤與正常結(jié)直腸黏膜組織中共篩選出381個DEGs，其中上調(diào)基因248個，下調(diào)基因133個，見圖1a；對差異表達(dá)最大的50個基因進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果見圖1b。

圖1 結(jié)直腸腺瘤DEGs篩選結(jié)果

2.2 DEGs的GO分析結(jié)果 GO分析結(jié)果顯示，對于上調(diào)的248個DEGs，其生物學(xué)過程（biological process,BP）主要富集于碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)、趨化因子介導(dǎo)的信號通路、鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)等（圖2a），細(xì)胞成分（cellular component,CC）富集于細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外泌體、蛋白性細(xì)胞外基質(zhì)等（圖2b），分子功能（molecular function,MF）富集于激素激活、趨化因子激活、趨化因子與受體結(jié)合等（圖2c）；對于下調(diào)的133個DEGs，其BP主要富集于趨化因子介導(dǎo)的信號通路、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等（圖2d），CC富集于細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外泌體、蛋白性細(xì)胞外基質(zhì)等（圖2e），MF富集于趨化因子激活、CXCR趨化因子與受體結(jié)合、鈣離子結(jié)合等（圖 2f）。

2.3 DEGs的KEGG分析結(jié)果 KEGG分析結(jié)果顯示，上調(diào)的248個DEGs主要涉及消化液分泌、藥物代謝、趨化因子受體相互作用等（圖3a）；下調(diào)的133個DEGs主要富集于趨化因子信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、軍團(tuán)菌感染等（圖3b）。

圖2 DEGs的GO分析結(jié)果

圖3 DEGs的KEGG分析結(jié)果

2.4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 利用STRING數(shù)據(jù)庫對結(jié)直腸腺瘤DEGs進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其PPI網(wǎng)絡(luò)由247個節(jié)點(diǎn)蛋白和579條相互作用關(guān)系構(gòu)成（圖4），將輸出結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)一步篩選關(guān)鍵基因（圖5），排名前10的中心節(jié)點(diǎn)蛋白分別是IL-8、趨化因子CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、 趨 化 因 子CCL19、CCL20、前血小板堿性蛋白（PPBP）、血小板因子4（PF4），對應(yīng)的關(guān)鍵基因分別是 IL-8、CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、CCL19、CCL20、PPBP、PF-4。

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜而又漫長的過程，其分子機(jī)制涉及多個基因的改變[9]。雖然近年來結(jié)直腸癌相關(guān)研究不斷增多，但目前對其所知仍然十分有限，尋找結(jié)直腸癌關(guān)鍵基因并研究其分子機(jī)制意義重大。近幾年快速發(fā)展的高通量芯片技術(shù)能夠在全基因組水平研究疾病的基因表達(dá)譜，為分子水平探索人類疾病發(fā)生機(jī)制提供了重要技術(shù)支持[3]。生物信息學(xué)作為一門新興的交叉學(xué)科，可以通過整合生物學(xué)、計算機(jī)、數(shù)學(xué)這些不同學(xué)科的優(yōu)勢對生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘分析，獲取需要信息并進(jìn)一步深入研究，最終為研究疾病分子機(jī)制提供理論依據(jù)。目前生物信息學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于分析高通量芯片、轉(zhuǎn)錄組測序等數(shù)據(jù)，它能夠發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因并預(yù)測其可能的生物學(xué)功能[10]，從而找出疾病新的診治靶點(diǎn)，對疾病診斷標(biāo)志物的研究和新藥的研發(fā)具有重要意義。

圖4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)中前10個關(guān)鍵基因

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對結(jié)直腸腺瘤基因芯片GSE8671進(jìn)行分析，共篩選出了381個DEGs，其中248基因在結(jié)直腸腺瘤中表達(dá)上調(diào)，133個基因在結(jié)直腸腺瘤中表達(dá)下調(diào)。對DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)生物學(xué)功能主要與激素激活、趨化因子激活、趨化因子受體結(jié)合等密切相關(guān)，而KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要參與趨化因子信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、藥物代謝等信號通路。用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出處于最核心位置的10個關(guān)鍵基因，分別是 IL-8、CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、CCL19、CCL20、PPBP、PF-4。

本研究結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)中的各類細(xì)胞因子可能在結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。事實(shí)上人類許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中都伴有慢性炎癥反應(yīng)，炎癥可以通過釋放細(xì)胞因子、產(chǎn)生自由基、損傷DNA，促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖等而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[11]。結(jié)直腸癌是一種公認(rèn)與慢性炎癥密切相關(guān)的惡性腫瘤[12]。目前的研究結(jié)果顯示TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、干擾素 γ（IFN-γ）、IL-6、IL-8 等細(xì)胞因子均參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。如TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在病理情況下TNF-α可以促進(jìn)NF-κB表達(dá)，而NF-κB又進(jìn)一步通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白 D1（cyclin D1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等基因發(fā)揮促癌作用[14]。TGF-β對結(jié)直腸癌的影響和腫瘤發(fā)展階段有關(guān)，目前認(rèn)為在早期結(jié)直腸癌中TGF-β主要發(fā)揮抑癌作用[15]，但其高表達(dá)卻與晚期結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[16]，似乎又暗示TGF-β具有促癌作用，這看似矛盾現(xiàn)象的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步闡明，可見細(xì)胞因子對結(jié)直腸癌的影響和作用及其復(fù)雜。本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出10個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白均屬于細(xì)胞因子，除了IL-8為IL家族，其余9個均屬于趨化因子家族，其中PPBP也叫CXCL7，PF-4也叫CXCL4。IL家族中以IL-6和結(jié)直腸癌的關(guān)系被研究的最為透徹，研究發(fā)現(xiàn)IL-6同樣是NF-κB下游靶基因，當(dāng)IL-6被異常激活后可以進(jìn)一步通過糖蛋白130（gp130）上調(diào)癌基因信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）表達(dá)[17-18]，表明IL-6通過參與NF-κB/IL-6/gp130/STAT3通路在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促癌作用。Cui等[19]發(fā)現(xiàn)IL-8表達(dá)水平在正常結(jié)直腸黏膜-結(jié)直腸腺瘤-結(jié)直腸腺癌進(jìn)展過程中逐步遞增，研究認(rèn)為IL-8主要通過結(jié)合趨化因子CXC受體1（CXCR1）和CXCR2后促進(jìn)下游癌基因表達(dá)而引起結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成[20]。CXC類趨化因子家族成員眾多并且功能各異，包括CXCL1、CXCL12、CXCL13、CXCL11、CXCL2、CXCL7、CXCL4 在內(nèi)的成員已經(jīng)被越來越多的研究證實(shí)可以和各自配體結(jié)合后參與結(jié)直腸癌細(xì)胞生存、腫瘤生長、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成等生物學(xué)過程[20-21]。作為CC類趨化因子的2個成員，CCL19在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用[22]，而CCL20卻能促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展并與腫瘤患者不良預(yù)后有關(guān)[23]，但具體機(jī)制目前仍不明確。

綜上所述，各類細(xì)胞因子尤其是趨化因子廣泛參與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展，本研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子同樣和結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此可以推測正是炎癥反應(yīng)中的各種細(xì)胞因子促進(jìn)了正常結(jié)直腸黏膜-結(jié)直腸腺瘤-結(jié)直腸腺癌這一演變過程。