何東元 陳建國(guó) 陳宜方 鄭志貴

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是終末期腎病（end stage kidney disease,ESKD）的首要病因，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚[1]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，足細(xì)胞足突融合是DN患者蛋白尿的重要原因。p-130Cas作為接頭蛋白，參與足細(xì)胞及其他多種細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)與多種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞遷移、存活和增殖[2-3]。p-130Cas連接細(xì)胞骨架、腎小球基底膜和裂孔膜，對(duì)維持足細(xì)胞形態(tài)和功能有重要作用[4]。高糖誘導(dǎo)下，p-130Cas表達(dá)異?？赡苁亲慵?xì)胞足突融合的重要環(huán)節(jié)。黃芪甲苷（AS-IV）是中藥黃芪的主要活性成分，既往研究報(bào)道AS-IV可緩解DN大鼠腎小球足細(xì)胞足突融合，減輕蛋白尿[5-6]，但作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討AS-IV是否可能通過(guò)調(diào)節(jié)p-130Cas的表達(dá)來(lái)抑制足細(xì)胞足突融合，起到緩解DN的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 鏈脲霉素（STZ）、AS-IV單體（TLC純度98%）、羧甲基纖維素（美國(guó)Sigma公司），Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript RT kit Total、Alexa 594（紅色）和Alexa 488（綠色）標(biāo)記的二抗（美國(guó)Invitrogen公司），抗p-130Cas、抗Synaptopodin、抗GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、ECL化學(xué)發(fā)光劑（美國(guó)Santa Cruz公司），RAPA蛋白裂解緩沖液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（中國(guó)上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；熒光顯微鏡（日本尼康公司），Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），Rotor-Gene3000 PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）。

1.2 方法

1.2.1 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 足細(xì)胞（浙江醫(yī)院生物實(shí)驗(yàn)室提供）培養(yǎng)在含10U/ml干擾素、10%FBS、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素 RPMI 1640培養(yǎng)液中，在33℃環(huán)境下培養(yǎng)傳代，在37℃、無(wú)干擾素條件下培養(yǎng)14d誘導(dǎo)分化。分化的足細(xì)胞用含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，后分為以下4組：正常對(duì)照組（NC組）：D-葡萄糖 5mmol/L；高糖組（HG 組）：D-葡萄糖 30mmol/L；高糖+低劑量AS-IV組（HG+LD組）：D-葡萄糖30mmol/L，AS-IV 50mg/L；高糖+高劑量AS-IV組（HG+HD組）：D-葡萄糖 30mmol/L，AS-IV 100mg/L。

1.2.1.2 Real time-PCR檢測(cè)p-130Cas mRNA的表達(dá) Trizol提取各組足細(xì)胞干預(yù)24、48h后的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript RT kit Total合成cDNA。p-130Cas上游序列為5′-CTACCCTCACCTCCAAAGTTC-3′，下游序列為 5′-CAGTTCCTTCTGGGTCTTCTC-3′。GAPDH為內(nèi)參，上游序列為 5′-TCCCTCAACATTGTCAGCAA-3′， 下 游 序 列 為 5′-AGCTCCACAACGGATACATT-3′。Rotor-Gene3000 PCR 儀進(jìn)行Realtime-PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5min，95℃變性 10s，59℃退火15s，72℃延伸 20s，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。熒光定量分析軟件讀取并計(jì)算目標(biāo)mRNA/GAPDH mRNA的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值代表p-130Cas mRNA的表達(dá)水平。

1.2.1.3 Western blot檢測(cè)p-130Cas蛋白的表達(dá) SDSPAGE凝膠電泳分離各組足細(xì)胞干預(yù)24、48h后的蛋白，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。含2%牛血清白蛋白的TBST（20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1%Tween-20）室溫1h封閉非特異位點(diǎn)，抗p-130Cas和抗GAPDH抗體4℃孵育24h，TBST洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下放置1h，ECL液顯色，X線片上曝光顯影、定影、沖洗、晾干。Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶光密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值代表p-130Cas蛋白的表達(dá)水平。

1.2.2 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 動(dòng)物分組 180～220g的健康雄性SD大鼠購(gòu)買自浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（Con組），糖尿病組（DN組），糖尿病+低劑量AS-IV（5mg/kg/d）組（DN+LD）組，糖尿病+高劑量 AS-IV（10mg/kg/d）組（DN+HD組）。每組10只大鼠。鏈脲霉素65mg/kg單次腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型。鏈脲霉素注射72h后空腹血糖＞16.67mmol/L的大鼠認(rèn)為造模成功。高糖+低劑量AS-IV組、高糖+高劑量AS-IV組AS-IV干預(yù)在糖尿病造模成功后開(kāi)始，持續(xù)8周。ASIV用1%羧甲基纖維素配置，灌胃給藥。Con組與DN組每日予同等劑量的羧甲基纖維素溶液，持續(xù)8周。在干預(yù)第4周末和第8周末檢測(cè)各組大鼠24h尿白蛋白。第8周末處死大鼠，留取腎臟組織以作后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2.2 病理學(xué)檢測(cè)腎臟組織形態(tài)改變 （1）4%多聚甲醛固定各組大鼠腎皮質(zhì)組織，常規(guī)石蠟切片，PASM和Masson染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)改變。（2）2%戊二醛固定各組大鼠腎皮質(zhì)組織，透射電鏡制樣、切片，電鏡下觀察足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.2.3 免疫熒光檢測(cè)p-130Cas蛋白的表達(dá) 4%多聚甲醛固定各組大鼠腎組織冷凍切片15min，0.5%Triton X-100室溫穿透20min，PBS浸洗3次，正常山羊血清室溫封閉30min，滴加一抗4℃濕盒內(nèi)孵育24h，滴加稀釋好的熒光二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育1h，DAPI避光孵育5min染核，封片液封片，熒光顯微鏡采集圖像觀察p-130Cas蛋白的表達(dá)情況。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較（1）4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA與蛋白表達(dá)水平；（2）4組大鼠24h尿白蛋白水平，腎臟病理學(xué)改變情況，腎臟足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Stat 12.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1。

圖1 4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)水平比較

由圖1可見(jiàn)，干預(yù)后24、48h，4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），HG 組高于 NC組（均 P＜0.05），HG+LD、HG+HD 組均低于HG組（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境下足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的p-130Cas mRNA表達(dá)上調(diào)。

2.2 4組足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖2。

圖3 4組大鼠腎臟病理學(xué)改變光鏡下所見(jiàn)（×200）

由圖2可見(jiàn)，干預(yù)后24、48h，4組足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），HG 組高于NC組（均 P＜0.05），HG+LD、HG+HD 組均低于HG組（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境下足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的p-130Cas蛋白表達(dá)上調(diào)。

2.3 4組大鼠24h尿白蛋白水平比較 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，干預(yù)第4、8周末，4組大鼠24h尿白蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），DN組高于Con組（均P＜0.05），DN+LD、DN+HD 組均低于DN組（均P＜0.05）。即糖尿病大鼠24h尿白蛋白水平明顯上升，AS-IV劑量依賴性降低糖尿病大鼠24h尿白蛋白水平。

表1 4組大鼠24h尿白蛋白水平比較（mg）

2.4 4組大鼠腎臟病理學(xué)改變 見(jiàn)圖3（插頁(yè)）、4。

由圖3可見(jiàn)，糖尿病大鼠腎小球增大，系膜增生，AS-IV劑量依賴性緩解糖尿病大鼠腎小球病變。由圖4可見(jiàn)，糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞足突顯著融合，AS-IV劑量依賴性抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞足突融合。

2.5 4組大鼠腎臟足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖5（插頁(yè)）。

圖4 4組大鼠腎臟病理學(xué)改變電鏡下所見(jiàn)（×4200）

圖5 4組大鼠腎臟足細(xì)胞p-130Cas蛋白免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（×400）

由圖5可見(jiàn)，糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，AS-IV可抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白上調(diào)。

3 討論

從糖尿病的首次被記載到發(fā)現(xiàn)糖尿病與腎臟疾病的關(guān)系，人類花了超過(guò)300年時(shí)間；但僅僅幾十年時(shí)間，DN就成了ESKD的首要病因[7]。DN的自然病程包括腎小球高濾過(guò)、進(jìn)展性蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率下降，最終導(dǎo)致ESKD[8]。DN最早期的病理學(xué)改變是腎小球基底膜增厚，其他變化包括內(nèi)皮細(xì)胞窗孔喪失、系膜增生、足細(xì)胞足突融合和足細(xì)胞丟失[8-9]。本研究成功建立糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠在第4周末出現(xiàn)白蛋白尿，第8周末白蛋白尿進(jìn)一步加重。光鏡下病理學(xué)顯示糖尿病大鼠出現(xiàn)腎小球增大和系膜增生。AS-IV劑量依賴性降低糖尿病大鼠白蛋白尿，緩解糖尿病腎臟病理學(xué)改變。

足細(xì)胞在DN中扮演重要角色[10]。足細(xì)胞由功能和形態(tài)不同的3部分組成：細(xì)胞體、主要突觸和足突。足突間25～60nm的間隔由裂孔膜覆蓋。疾病狀態(tài)下足突的細(xì)胞骨架發(fā)生重排，由平行束狀變成致密的網(wǎng)狀，足突融合，腎小球通透性增加，臨床表現(xiàn)為蛋白尿。足突的細(xì)胞骨架由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成[11]。足突融合不是被動(dòng)現(xiàn)象，而是消耗能量的主動(dòng)過(guò)程。足突融合的機(jī)制十分復(fù)雜，尚未完全闡明。目前認(rèn)為引起足突融合的可能機(jī)制為：（1）病變直接干擾了足細(xì)胞的細(xì)胞骨架及其與α-actinin-4的聯(lián)系；（2）病變干擾了足突與基底膜之間的相互作用；（3）足細(xì)胞頂區(qū)受損，負(fù)電荷屏障破壞；（4）裂孔隔膜復(fù)合體及其相關(guān)的脂閥損傷[2]。足細(xì)胞足突融合是DN蛋白尿的關(guān)鍵。本研究電鏡下顯示糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯足細(xì)胞足突融合，AS-IV劑量依賴性緩解糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞足突融合。

p-130Cas屬于Crk相關(guān)底物家族（Crk-associated substrate，Cas）成員。Cas作為接頭蛋白幾乎無(wú)處不在，在細(xì)胞黏附、遷移、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架間的信號(hào)傳導(dǎo)中均有重要作用[2]。Cas蛋白的過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架改變，促進(jìn)細(xì)胞偽足的形成[12]。研究顯示，p-130Cas表現(xiàn)上調(diào)與乳腺癌、卵巢癌和肝癌進(jìn)展相關(guān)[12]。足細(xì)胞中p-130Cas彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中，在足細(xì)胞足突肌動(dòng)蛋白纖維末端聚集。p-130Cas一方面通過(guò)CD2AP等接頭蛋白與裂孔膜相連，另一方面通過(guò)局部黏附激酶及整合素與腎小球基底膜相連。高糖誘導(dǎo)的p-130Cas表達(dá)異?？赡苁荄N足細(xì)胞足突融合的重要環(huán)節(jié)。膜性腎病患者足細(xì)胞p-130Cas上調(diào)，而微小病變腎病患者足細(xì)胞p-130Cas下調(diào)[13]。雖然均出現(xiàn)足細(xì)胞足突融合，微小病變和膜性腎病發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)截然不同。因此足細(xì)胞p-130Cas表達(dá)變化和疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)。synaptopodin是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，只表達(dá)于腎小球的足細(xì)胞和后腦的突觸內(nèi)[14]。本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)synaptopodin，定位足細(xì)胞，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，AS-IV劑量依賴性抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)上調(diào)。體外研究和體內(nèi)研究結(jié)果一致。高糖環(huán)境下足細(xì)胞p-130Cas蛋白與mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞p-130Cas蛋白與mRNA上調(diào)。

綜上所述，AS-IV可能通過(guò)抑制p-130Cas表達(dá)上調(diào)抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞足突融合，緩解DN。本研究結(jié)果或?yàn)镈N的早期治療提供理論參考。