馬英，劉星，楊春壯，王子軒，雷瀛，王林林

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011)

腦血管病具有高發(fā)病率、病死率、致殘率、復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，對人類生命安全和健康造成嚴(yán)重的危害，臨床上以缺血性腦血管病多見。缺血性腦血管疾病多為局灶性，以大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)多見。部分梗塞患者由于溶栓治療或栓子自發(fā)向遠(yuǎn)端推移，出現(xiàn)血管再通即再灌注現(xiàn)象。地卓西平馬來酸鹽(MK-801)是離子型谷氨酸受體拮抗劑，可阻斷N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體，明顯降低腦缺血再灌注引起的腦損傷。有研究認(rèn)為，MK-801可降低Ca2+濃度，維持Ca2+在細(xì)胞內(nèi)外的平衡，抑制興奮性氨基酸毒性，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的增殖，同時(shí)抑制神經(jīng)元的凋亡，在治療腦損傷、缺血性腦血管疾病、抗驚厥等方面發(fā)揮重要作用[1,2]。MK-801在腦缺血再灌注后對神經(jīng)元的保護(hù)作用已得到初步證實(shí)，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究觀察了MK-801對MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康Wistar大鼠108只，雌雄各半，體質(zhì)量200～350 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號為SYXX(黑)2015-007。

1.2 藥物、儀器及試劑 MK-801(美國Sigma公司)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo熱電上海儀器有限公司)；神經(jīng)生長因子β(NGFβ)酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德生物公司)；巢蛋白(NES)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、MCAO模型制備及MK-801給予方法 108只大鼠隨機(jī)分為藥物組、模型組、對照組各36只。藥物組、模型組均制備MCAO模型[3]，即大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)，仰臥并固定于鼠板上，在大鼠頸部前正中線縱行切口，長2.0～2.5 cm，鈍性分離筋膜、肌肉及甲狀腺腺體，注意減少刺激迷走神經(jīng)，分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，再穿一線備用。分離頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)，結(jié)扎ECA，用微動(dòng)脈夾夾閉ICA，在近CCA分叉處剪一V形切口，將直徑為0.2～0.25 mm尼龍線頭端涂抹硅膠脂，沿CCA插入ICA，同時(shí)放開微動(dòng)脈夾，輕輕牽拉使栓線進(jìn)入顱腔，插入深度18～20 mm，稍遇阻力即停，說明線栓已阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)的入口，造成MCA阻塞。將CCA上的備線扎緊，防止線栓滑出，縫合傷口，涂抹青霉素抗炎。1 h后，緩慢退出部分線栓進(jìn)行再灌注。對照組只做手術(shù)暴露頸部動(dòng)脈，結(jié)扎CCA，但不予線栓。制模后大鼠清醒后腹腔注射MK-801(用0.9%生理鹽水配置成濃度為0.06 mg/mL的溶液)，1次/d，給藥14 d；模型組和對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評價(jià) 在制模第3、7、14 d大鼠處死前分別進(jìn)行神經(jīng)功能評分[4]。無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)計(jì)0分，提尾懸空時(shí)左前爪不能伸展計(jì)1分，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分，行走困難、并不時(shí)地向左側(cè)傾倒計(jì)3分，不能自主行走、意識下降計(jì)4分。

1.5 大鼠大腦皮質(zhì)NGF、NES檢測 各組動(dòng)物分別于制模第3、7、14 d禁食過夜，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取8只處死，迅速在冰盤上修取MCA供血區(qū)(右側(cè)缺血側(cè))的大腦皮質(zhì)，用濾紙?zhí)幚淼麴じ降哪X脊液和血液，稱重標(biāo)記后按1∶9的比例配入冰生理鹽水，置于勻漿器勻漿，離心機(jī)以3 000 r/min離心30 min，取上清，采用ELISA法檢測NGF，結(jié)果以O(shè)D值表示。同時(shí)每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)將剩余4只進(jìn)行常規(guī)灌注固定，取出大腦，取MCA供血區(qū)(右側(cè)缺血側(cè))中間部分的大腦皮質(zhì)，置于4%多聚甲醛固定液中，4 ℃浸潤固定，經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片(5 μm)，采用免疫組化法檢測NES，每例標(biāo)本檢測4張切片，每張切片各取5個(gè)高倍視野(40×)，測定NES累積光密度值和總面積，把兩者的比值作為平均光密度值(IOD值)，最后計(jì)算每組動(dòng)物的均值。

2 結(jié)果

2.1 各組制模3、7、14 d大鼠神經(jīng)功能評分比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠制模3、7、14 d神經(jīng)功能評分比較(分，

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組大鼠制模3、7、14 d大腦皮質(zhì)NGF OD值比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠制模3、7、14 d大腦皮質(zhì)NGF OD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 各組大鼠制模3、7、14 d腦皮質(zhì)NES IOD值比較 結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠制模3、7、14 d腦皮質(zhì)NES IOD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

缺血性腦血管病是指局部腦組織包括神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及聯(lián)系纖維由于供血障礙發(fā)生的變性、壞死或一過性的功能喪失。腦動(dòng)脈一旦受到阻塞，腦組織就會(huì)以為沒有足夠的血液灌注，而引發(fā)腦血管缺血、缺氧，缺血性腦血管病的一系列生理、病理的演變過程也隨之開始，而這一演變過程的最終結(jié)果就是神經(jīng)元死亡及神經(jīng)功能缺損。缺血性腦血管病是一種常見病，發(fā)病后對患者造成的損傷很大，且很難徹底治愈，影響其發(fā)病的因素很多也很復(fù)雜。最常見的治療方法仍是藥物治療，因此如何合理地選擇治療的藥物已成為目前缺血性腦血管病討論的焦點(diǎn)。

腦缺血性損傷時(shí)，谷氨酸在突觸間隙中積聚，NMDA受體過度興奮，從而引發(fā)Ca2+超載、NO生成增多等級聯(lián)式毒性反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[5～7]。MK-801是特異性最強(qiáng)、效能最高的非競爭性NMDA受體拮抗劑，主要作用于NMDA受體之苯環(huán)己派啶位點(diǎn)，阻斷與之耦聯(lián)的Ca2+通道，抑制Ca2+內(nèi)流，從而減輕NMDA受體激動(dòng)所引發(fā)的神經(jīng)損傷，有研究表明[8]，MK801可能通過間接抑制脂質(zhì)過氧化損傷作用,維持神經(jīng)元細(xì)胞膜的完整性,減弱促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。從而對缺血再灌注后的腦組織具有一定的保護(hù)意義。從而在治療腦損傷、缺血性腦血管疾病及抗驚厥等方面發(fā)揮重要作用[9]。

實(shí)驗(yàn)性腦缺血的行為學(xué)評價(jià)方法可分為神經(jīng)學(xué)檢查、感覺運(yùn)動(dòng)功能的評價(jià)和認(rèn)知功能的評價(jià)。感覺運(yùn)動(dòng)功能的評價(jià)多用于實(shí)驗(yàn)性腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的遠(yuǎn)期過程，此評價(jià)能較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物不同程度腦缺血后的運(yùn)動(dòng)和感覺功能損傷，是較神經(jīng)學(xué)檢查更敏感且定位相對準(zhǔn)確的功能障礙評價(jià)方法。本研究顯示，藥物組第3、7天神經(jīng)功能評分與模型組比較無差異，制模14 d神經(jīng)功能評分低于模型組，提示MK-801可改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但需要一定的時(shí)間。

NGF在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布，其與受體p75NTR和TrkA結(jié)合后，能對神經(jīng)元的生存、生長、增殖、分化、遷移及突觸的形成和連接起促進(jìn)作用[10～12]。有研究[13]表明，成年哺乳動(dòng)物因腦缺血造成的神經(jīng)功能損傷產(chǎn)生代償性和修復(fù)作用，與缺血、缺氧導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，誘導(dǎo)各種NGF的表達(dá)發(fā)生變化有關(guān)。本研究顯示，對照組NGF表達(dá)在制模后幾天無明顯差異，模型組從制模后第3天開始表達(dá)升高，第7天達(dá)到高峰，接近對照組的水平，到第14天表達(dá)下降。這一結(jié)果也證實(shí)腦缺血后可引起內(nèi)源性NGF表達(dá)增加，但此過程只使內(nèi)源性NGF短暫表達(dá)增加，不能全面且持久地保護(hù)受損神經(jīng)元。本研究還發(fā)現(xiàn)，藥物組不同時(shí)間點(diǎn)NGF OD值均高于模型組和對照組。說明MK-801能促使MCAO大鼠在腦缺血時(shí)的NGF產(chǎn)生量增加、產(chǎn)生時(shí)限延長，從而對受損傷神經(jīng)元發(fā)揮更好的保護(hù)作用。

NES屬于一種胚胎性第Ⅵ類中間絲蛋白，主要分布在胚胎發(fā)生期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在干細(xì)胞增殖旺盛階段出現(xiàn)大量表達(dá)，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成。從成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出的NES陽性細(xì)胞在體外培養(yǎng)呈集落性生長，并分化出神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，從而說明NES陽性細(xì)胞具有干細(xì)胞特征。目前，NES作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中NSCs的特異性標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于NSCs的鑒定[14,15]。研究認(rèn)為，在腦缺血情況下，神經(jīng)干細(xì)胞可以增殖并遷移到病灶區(qū)，進(jìn)而產(chǎn)生定向分化[16,17]。于東強(qiáng)等[18]報(bào)道，雄性Wistar大鼠在局灶性腦缺血再灌注損傷后，缺血同側(cè)及對側(cè)海馬區(qū)NES陽性細(xì)胞數(shù)量增多，7 d達(dá)到高峰，表明神經(jīng)干細(xì)胞參與了腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)的自我修復(fù)。本文結(jié)果顯示，藥物組和模型組不同時(shí)間點(diǎn)NES表達(dá)均高于對照組，藥物組不同時(shí)間點(diǎn)NES表達(dá)均高于模型組，可見腦缺血后機(jī)體內(nèi)部的NES蛋白被激活，經(jīng)MK-801的作用表達(dá)得更為明顯。這表明MK-801可增強(qiáng)NES陽性細(xì)胞的表達(dá)，刺激內(nèi)源性NSCs激活，進(jìn)而增殖、分化及定向遷移，并分化出神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，達(dá)到修復(fù)和重塑受損神經(jīng)的作用。但此過程具體機(jī)制目前還不十分明確，本研究認(rèn)為這與MK-801抑制興奮性氨基酸毒性、調(diào)節(jié)微環(huán)境(生長因子、細(xì)胞因子)有關(guān)。

總之，MK-801可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能，其機(jī)制可能是通過增加MCAO大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)NGF、NES水平來實(shí)現(xiàn)。