王璐芳, 李春梅, 許佳彬, 李 慧, 蘇 杭, 王 靜, 金 芬*, 張 宇*

(1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, 海南 海口 570228; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 北京 100081)

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(strobilurin fungicides)是一類廣譜性殺菌劑,對(duì)擔(dān)子菌綱、半知菌綱和卵菌綱等真菌具有高殺菌活性[1-5]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑由于其獨(dú)特作用機(jī)制及廣譜殺菌活性,已成為繼苯丙咪唑類和三唑類殺菌劑之后極具市場(chǎng)潛力的一類殺菌劑。目前甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑種類已達(dá)15種,其中肟菌酯、氟嘧菌酯和啶氧菌酯的農(nóng)藥市場(chǎng)占比分別達(dá)到18.45% 、5.52%和5.05%[6];此外,烯肟菌酯、丁香菌酯、烯肟菌胺、氯啶菌酯和唑菌酯等的登記使用范圍也逐漸擴(kuò)大,而有關(guān)此類殺菌劑的檢測(cè)方法及殘留水平等研究缺乏,有必要建立該類殺菌劑的多殘留檢測(cè)方法。大部分甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在施用后,會(huì)進(jìn)入土壤,具有潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[7,8]。已有研究表明,脂溶性強(qiáng)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在土壤中易與土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合,也可通過雨水淋溶等方式進(jìn)入水體,進(jìn)一步影響水生生物,從而通過食物鏈威脅人類健康[9]。近年來甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的毒性也日益受到關(guān)注,醚菌酯、啶氧菌酯及肟菌酯能引起大鼠輕微肝細(xì)胞水腫[10]、赤眼蜂行為異常[11]及魚類胚胎發(fā)育不正常[12-14]等。因此,研究建立土壤中的丁香菌酯、唑菌酯、烯肟菌胺、氯啶菌酯、肟醚菌胺、E-苯氧菌胺、醚菌酯、醚菌胺、啶氧菌酯、肟菌酯及氟嘧菌酯等11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的多殘留分析方法對(duì)研究其環(huán)境行為及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等具有重要意義。

目前,土壤中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測(cè)方法已有報(bào)道[15-18]。郭敏等[15]采用丙酮提取測(cè)定了土壤中的啶氧菌酯和肟菌酯。丁琦等[16]采用乙腈振蕩提取、石油醚復(fù)溶后中性氧化鋁柱層析凈化法測(cè)定了土壤中丁香菌酯的殘留。Herrerohernández等[17]采用甲醇提取了土壤中的嘧菌酯。然而,這些方法只針對(duì)其中幾種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。

我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤類型豐富,主要包括南方紅黃壤、黃土性土壤、干旱區(qū)土壤、東北森林草原土壤和砂土等。不同類型的土壤有機(jī)質(zhì)含量、粘粒含量及酸堿度等理化性質(zhì)差別很大,其所含的色素、腐殖質(zhì)等極性雜質(zhì)的含量亦有所不同,對(duì)農(nóng)藥的吸附特性也不同[19],因此,針對(duì)不同植被類型土壤進(jìn)行提取凈化的效果也有所不同。本文根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)區(qū)土壤的分布和理化性質(zhì),采集了6種典型的植被類型土壤(黑土、紅壤土、砂土、潮土、灰漠土、高山土),以此為研究對(duì)象,考察了不同凈化劑對(duì)11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑回收率的影響,建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定土壤中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-MS/MS 8050(日本Shimadzu公司), ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國(guó)Waters公司)。高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司),超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司),渦旋混合器(美國(guó)Scientific Industries公司),電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司), Milli-Q超純水發(fā)生器(德國(guó)Merck公司)。

甲醇和乙腈均為HPLC級(jí),購(gòu)自德國(guó)Merck公司;N-丙基乙二胺(PSA, 40～60 μm)、C18(40 μm)和多壁碳納米管(MWNT, 18～20 nm)購(gòu)自天津博納艾杰爾科技公司;石墨化碳黑(GCB, 38～120 μm)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于90% ,其中丁香菌酯、唑菌酯和烯肟菌胺購(gòu)自美國(guó)Chemtek公司,氟嘧菌酯、氯啶菌酯、醚菌酯、啶氧菌酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌胺和E-苯氧菌胺購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱取11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,用甲苯定容至10 mL,配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的儲(chǔ)備液,密封后避光存于4 ℃,備用。分別取上述配制好的單標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各1 mL,置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度線,配制成20 mg/L的工作液,備用。

土壤樣品:黑土、灰漠土、高山土、潮土、紅壤土和砂土分別采自中國(guó)吉林、新疆、青海、河北、江西、海南6地,風(fēng)干,過2 mm篩,4 ℃保存待用。6種土壤的理化性質(zhì)見表1。

表 1 6種植被類型土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of the six vegetation types of soil

CEC: cation exchange capacity.

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取風(fēng)干的10.0 g土樣于50 mL塑料離心管中,加入10 mL 0.1%(v/v)醋酸乙腈,渦旋混勻1 min,超聲提取5 min,以6 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液置于含有PSA和C18的5 mL離心管中,渦旋1 min,以6 000 r/min離心5 min,取上清液,過0.22 μm濾膜,待測(cè)。

1.3 LC-MS/MS條件

色譜條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣體積為1 μL。流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為水,流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 40%A, 60%B; 1.0～2.5 min, 60%A, 40%B; 2.5～4.0 min, 80%A, 20%B; 4.0～5.5 min, 90%A, 10%B; 5.5～8.5 min, 40%A, 60%B。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧離子源,正離子模式,掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表 2 11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Retention time and mass parameters of the 11 strobilurin fungicides

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

* Quantitative ion.

圖 1 11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(50 μg/kg)在不同流動(dòng)相條件下的色譜圖比較Fig. 1 Comparison of chromatograms of the 11 strobilurin fungicides (50 μg/kg) in different mobile phases

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS條件優(yōu)化

本研究比較了有機(jī)相甲醇和乙腈對(duì)11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑分離效果的影響,如圖1所示,當(dāng)采用乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí),僅丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺和E-苯氧菌胺的響應(yīng)值較高,氟嘧菌酯未出峰,這可能是因?yàn)榉拙O性較強(qiáng),應(yīng)使用極性更強(qiáng)的甲醇對(duì)該藥進(jìn)行洗脫。而當(dāng)采用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí),氟嘧菌酯出峰(保留時(shí)間為2.62 min), 11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑均得到較好分離,保留時(shí)間為2.20～3.81 min,且氯啶菌酯、唑菌酯和醚菌酯等峰的響應(yīng)均有所提高。這可能是因?yàn)榧状紝儆谫|(zhì)子性有機(jī)溶劑,使目標(biāo)物更容易質(zhì)子化,提高了目標(biāo)物的洗脫能力,從而提高了檢測(cè)的靈敏度[20]。因此,本研究選擇甲醇-水作為分離11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的流動(dòng)相。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

近年來QuEChERS在提取土壤及食品中的農(nóng)藥上應(yīng)用廣泛[21,22]。針對(duì)土壤基質(zhì)較為復(fù)雜,含有有機(jī)質(zhì)及色素等多種雜質(zhì),本文采用QuEChERS方法對(duì)土壤基質(zhì)中的干擾物進(jìn)行凈化,提取11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。目前,QuEChERS方法常用的吸附凈化劑主要包括GCB、MWNT、C18和PSA等,其中GCB和MWNT對(duì)色素有較好的吸附效果,PSA對(duì)土壤中的極性共提取物有較好的吸附,而C18可以去除基質(zhì)的非極性雜質(zhì)[23]。本文首先比較了4種不同凈化劑(GCB、MWNT、C18及PSA各50 mg)對(duì)超純水中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的吸附效果。結(jié)果表明,GCB和MWNT對(duì)11種目標(biāo)物有較強(qiáng)的吸附能力,幾乎將丁香菌酯、氯啶菌酯、烯肟菌胺及唑菌酯全部吸附。又以有機(jī)質(zhì)含量最高的黑土作為基質(zhì)進(jìn)行凈化研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)GCB和MWNT處理后的土壤基質(zhì)中丁香菌酯、氯啶菌酯、烯肟菌胺和唑菌酯的回收率僅為3.38% ～62.53% ,進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩種凈化劑對(duì)目標(biāo)物有較強(qiáng)的吸附能力[24],不適合對(duì)土壤中丁香菌酯、氯啶菌酯等藥物的凈化。而經(jīng)PSA和C18處理后的土壤基質(zhì)中目標(biāo)物回收率為30.6% ～94.9% ,且與GCB和MWNT相比,PSA可吸附部分色素,達(dá)到凈化除色的效果,因此本研究選擇PSA和C18作為吸附凈化劑。

進(jìn)一步優(yōu)化PSA和C18的用量與組成。如圖2所示,當(dāng)100 mg PSA和100 mg C18單獨(dú)使用時(shí),除E-苯氧菌胺外,其余10種目標(biāo)物的回收率均較低;當(dāng)PSA和C18用量分別提高至200 mg時(shí),回收率得到較大提高,達(dá)到80.5% ～95.4% ;當(dāng)100 mg PSA和100 mg C18凈化劑混合使用時(shí),11種目標(biāo)物的回收率為94.1% ～112.1% ,能更好地滿足檢測(cè)需要。因此,最終選擇100 mg PSA和100 mg C18作為該方法的吸附劑。

圖 2 不同量的PSA和C18對(duì)黑土中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的凈化效果(n=3)Fig. 2 Effects of different amounts of PSA and C18 on the purification of the 11 strobilurin fungicides in black soil (n=3)

CompoundMoisture soilSandy soilBlack soilRed soil Plateau soilDesert grey soilCoumoxystrobin0.870.850.860.870.850.91Picoxystrobin0.870.820.891.030.961.04Tricyclopyricarb0.930.860.951.041.001.08Fluoxastrobin0.890.830.911.050.971.05E-Metominostrobin0.920.850.951.001.001.04Fenaminstrobin0.950.880.961.121.081.12Orysastrobin0.910.850.941.091.021.06Trifloxystrobin0.890.830.880.970.940.97Pyraoxystrobin0.940.870.920.970.951.02Dimoxystrobin0.890.830.860.930.900.94Kresoxim-methyl0.860.810.840.900.880.94

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)指樣品提取液中除目標(biāo)物外的其他組分對(duì)定量分析準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的影響[25],采用式(1)計(jì)算:

ME=km/ks

(1)

其中km為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,ks為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。參照1.2節(jié)方法對(duì)空白土壤樣品進(jìn)行前處理,制備空白基質(zhì)溶液。分別用純?nèi)軇┖涂瞻谆|(zhì)溶液配制藥物濃度相同的工作液,在相同儀器條件下檢測(cè),以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果如表3所示,6種不同類型植被土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的ME值為0.81～1.12,基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較小,表明本文所建立的QuEChERS前處理方法對(duì)目標(biāo)藥物的提取凈化效果較好。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在潮土、砂土和黑土3種土中均呈現(xiàn)微弱的基質(zhì)抑制效應(yīng),ME值為0.81～0.96;而在紅壤土、高山土和灰漠土中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑則呈現(xiàn)了不同的基質(zhì)效應(yīng)。丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺和醚菌酯等5種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在紅壤土、高山土和灰漠土(除唑菌酯外)中均呈現(xiàn)為弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME值為0.87～0.97);啶氧菌酯、氯啶菌酯、氟嘧菌酯、E-苯氧菌胺、烯肟菌胺和肟醚菌胺等6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在紅壤土、高山土(除氟嘧菌酯和啶氧菌酯外)和灰漠土中均表現(xiàn)為微弱的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME值為1.00～1.12。因此,采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)樣品進(jìn)行定量分析,以減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

如表4所示,采用優(yōu)化后的分析方法,將配制的工作液用處理后的空白土壤基質(zhì)逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為100、50、20、10、5、2、1、0.5和0.1 μg/kg的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。11種殺菌劑在0.1～100 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.980 5～0.999。分別以3倍和10倍信噪比確定該類藥物在土壤中的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表4。11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在6種土壤中的LODs值為0.005～2.3 μg/kg,低于現(xiàn)有文獻(xiàn)方法[26,27]的LODs,可以滿足我國(guó)土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的痕量檢測(cè)要求。

表 5 不同植被類型土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 5 Average recoveries and RSDs of the 11 strobilurin fungicides in different vegetation types of soil (n=3)

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在6種空白土壤中分別添加5、10和50 μg/kg水平的11種殺菌劑的混合標(biāo)準(zhǔn)液,每個(gè)水平重復(fù)3次,按照本方法對(duì)樣品進(jìn)行提取并檢測(cè),得到各添加水平下的平均回收率分別為65.1%～90.6% 、73.8%～95.8% 、80.5%～103.9% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.082%～7.8% 、0.13%～5.6% 、0.12%～14.0% ,結(jié)果見表5。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本文所建立的方法,分別對(duì)3個(gè)采自不同地點(diǎn)(河北、北京和海南)的土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)。在河北和海南的土壤樣品中均檢出了丁香菌酯(含量分別為0.1和0.2 μg/kg)、氯啶菌酯(均為0.2 μg/kg)和醚菌酯(均為0.2 μg/kg),其他8種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑均未檢出。結(jié)果表明,本方法適用于土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定不同植被土壤中11種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法。該方法簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好、靈敏度高、線性關(guān)系良好,適用于不同類型土壤中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的分析。