張愛芝, 李湘江, 王志強, 張書芬, 宋 悅, 曹麗麗, 蔡君美, 陳林吉

(寧波市食品檢驗檢測研究院, 浙江 寧波 315048)

2017年7月20日,比利時通過歐盟食品飼料類快速預警系統(tǒng)(RASFF)通報雞蛋中檢出氟蟲腈,截至2017年8月14日,問題雞蛋波及20個國家和地區(qū),被稱為“毒雞蛋”事件,引起公眾廣泛關注。氟蟲腈(fipronil)又名銳勁特(Regent),是一種苯基吡唑類殺蟲劑,對蚜蟲、葉蟬、飛虱、鱗翅目幼蟲、蠅類和鞘翅目等一系列害蟲均具有很高的殺蟲活性。研究表明,氟蟲腈對蜜蜂及水產動物具有極高毒性[1],國際食品法典委員會(CAC)[2]和日本肯定列表[3]、美國相關標準[4]、歐盟相關標準[5]中規(guī)定氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量分別為0.02、0.03和0.005 mg/kg。我國于2009年10月1日開始對該農藥限用,GB 2763-2016中明確了氟蟲腈及其代謝物在谷物、油料、油脂、蔬菜、水果、糖類和食用菌中的限量(玉米及鮮食玉米為0.1 mg/kg,其他為0.02 mg/kg),但未明確在蛋類中的限量。氟蟲腈常見的代謝物有氟甲腈(fipronil desulfinyl)、氟蟲腈砜(fipronil sulfone)、氟蟲腈硫醚(fipronil sulfide),其代謝路徑見圖1。

我國標準體系中氟蟲腈的檢測方法多為氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS),在國家標準GB 2763-2016中指定氟蟲腈的檢測方法為氣相色譜-質譜法,具體參照SN/T 1982和NY/T 1379。NY/T 1379標準方法的檢出限較高(0.01 mg/kg),無法滿足歐盟限量要求;SN/T 1982標準方法的檢出限(0. 002 mg/kg)可滿足要求,但需使用負化學源,普及率不高。其他涉及氟蟲腈的標準檢測方法有SN/T 4039-2014、GB 23200.8-2016、GB 23200.9-2016、GB 23200.7-2016等,但這些方法均未檢測氟蟲腈代謝物,且檢測基質均未包含雞蛋,實際上并不滿足GB 2763-2016的規(guī)定。

文獻[6,7]報道的氟蟲腈檢測方法的研究對象主要為蔬菜和水果,Zhang等[8]采用固相萃取小柱凈化的前處理方法建立了雞肉及雞蛋中氟蟲腈的檢測方法?！岸倦u蛋”事件爆出后,建立雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法成為熱點。沈偉健等[9]采用乙腈提取,結合QuEChERS凈化技術,建立了GC-MS測定禽蛋及其制品中氟蟲腈及其代謝物的方法;郭德華等[10]采用酸性乙腈提取,PRiME HLB SPE柱凈化,建立了液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(LC-QTOF MS)快速篩查禽蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝物的方法;勵炯等[11]采用酸性乙腈提取,建立了QuEChERS-LC-MS/MS測定禽蛋中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法。

本文通過乙腈提取、NaCl鹽析、稀釋后直接過膜上機的簡單前處理操作,建立了雞蛋中超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)快速測定氟蟲腈及其代謝物的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

UPLC I-Class Xevo TQ-XS超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國Waters公司); KS-300EI超聲波清洗器(寧波海曙超聲儀器公司); TGL-20M高速臺式冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司); Vortex 3自動漩渦混合器(德國IKA公司)。

標準品:氟蟲腈(1 000 mg/L)和氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚(100 mg/L)均購自農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測中心,純度均>98% 。甲醇、乙腈均為色譜純,購自德國Merck公司;乙酸、氯化鈉均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;實驗用水為超純水器(美國Millipore公司)制備的超純水,電阻率為18.2 MΩ5cm。

1.2 標準溶液的配制

將氟蟲腈及其代謝物用甲醇配制成質量濃度為1 mg/L的混合標準儲備液,于-18 ℃冰箱中保存;用乙腈-水(50∶50, v/v)配制成質量濃度為0.01、0.05、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/L的混合標準工作液,待用。

1.3 樣品前處理

稱取2 g已混勻的生雞蛋樣品,置于塑料離心管中,加入2 mL水和4 mL乙腈,超聲提取10 min,加入1 g NaCl,振蕩混勻,于4 ℃以9 000 r/min離心10 min,取上清液0.5 mL,加入0.5 mL水,過有機濾膜,待上機分析。

1.4 色譜-質譜條件

色譜柱:Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:15 ℃;流速:0.4 mL/min;流動相:A為水,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.50 min, 90%A; 1.50～3.50 min, 90%A～10%A; 3.50～5.00 min, 10%A; 5.00～5.01 min, 10%A～90%A; 5.01～7.00 min, 90%A。進樣體積:3 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,負離子模式;離子源溫度:150 ℃;毛細管電壓:1.08 kV;錐孔電壓:25 V;射頻透鏡1(RF lens)和射頻透鏡2電壓:15.0 V;脫溶劑溫度:600 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L/h;錐孔反吹氣流量:150 L/h;掃描模式:MRM監(jiān)測模式。氟蟲腈及其代謝物的采集參數見表1。

表 1 氟蟲腈及其代謝物的保留時間及質譜參數Table 1 Retention time and MS parameters of fipronil and its metabolites

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

QuEChERS方法多用于水果、蔬菜中農藥殘留檢測的前處理,其技術核心是在水果、蔬菜的提取液中加入除水劑和雜質吸附劑,經離心后直接進行儀器分析,方法簡單、快速、高效。本文參照QuEChERS方法，重點考察了樣品前處理的條件。

2.1.1加水量的選擇

BS-EN-15662標準[12]中采用QuEChERS方法作為蔬菜和水果中農藥殘留檢測的前處理方法,對于含水量小于80%的蔬菜和水果樣品,在加入提取劑之前應先加入適量水,以保證提取效果。這可能是因為水的加入可以使乙腈更好地浸入樣品內部,從而提高提取效率。雞蛋含水量較少,本文詳細研究了水的加入量對提取效率的影響(見圖2)。結果表明,在2 g雞蛋中加入2 mL水,提取效果最好,故選為實驗所用。

圖 2 加水量對目標化合物回收率的影響Fig. 2 Effect of the volume of water on the recoveries of the target compounds

圖 3 不同提取劑對目標化合物回收率的影響Fig. 3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the target compounds

2.1.2提取劑的選擇

農藥提取劑主要有乙腈、甲醇、酸化乙腈和甲醇等。采用陰性樣品加標的方式分別比較了甲醇、1%(v/v)乙酸甲醇、乙腈、1%(v/v)乙酸乙腈的提取效果(見圖3)。結果顯示,以甲醇和1%(v/v)乙酸甲醇為提取劑時,提取液渾濁且回收率只有30% ，可能原因是甲醇提取液含雜質較多,基質效應嚴重；以乙腈為提取劑時,提取液清澈干凈,提取效率較高,可能是因為氟蟲腈及其代謝物均含有-CN類基團,依據相似相容原理其更易被乙腈提取。在乙腈中引入1%(v/v)乙酸可保證部分農藥的穩(wěn)定性[12],但氟蟲腈在中性條件下較穩(wěn)定[13],因而不受影響。因此實驗最終選擇乙腈為提取劑。

2.1.3提取劑用量的選擇

稱取2 g樣品,加入2 mL水后,考察提取劑用量對提取效率的影響(見圖4)。結果表明,采用4 mL和6 mL乙腈時提取效率均較高,但采用6 mL乙腈時氟甲腈及氟蟲腈硫醚的回收率偏高。因此選用4 mL乙腈進行提取。

圖 4 提取劑用量對目標化合物回收率的影響Fig. 4 Effect of the amount of extraction solvents on the recoveries of the target compounds

2.1.4NaCl加入順序及加入量的選擇

在乙腈提取前加入NaCl,目標化合物的回收率較低,可能是因為NaCl水溶液與乙腈互溶性較差,乙腈不能很好地進入雞蛋溶液內部;在乙腈提取后加入NaCl,提取效果較好。NaCl的加入不僅能使有機相和水相充分分離,還能調節(jié)有機相的離子濃度,從而提高提取效率。

NaCl在水中的溶解度是20 g, NY/T 761-2008標準規(guī)定在農藥殘留檢測時需加入飽和氯化鈉溶液以保證提取效果。因此在加入2 mL水的雞蛋樣品溶液中加入1 g NaCl,使NaCl達到飽和狀態(tài)。

2.1.5離心溫度的選擇

在常溫條件下離心提取液,效果不理想,上清液較少。林濤等[6]嘗試冷凍提取鮮棗中的氟蟲腈,提取效果較好。這是因為溫度的降低會加速水相和乙腈相的分離,促使目標化合物向有機相轉移,從而提高提取效率。本實驗在4 ℃條件下離心,可獲得滿意的效果。

2.2 色譜-質譜條件的優(yōu)化

2.2.1質譜條件的優(yōu)化

氟蟲腈及其代謝物為苯基吡唑類化合物,其結構式中含有-CF3,為缺電子結構,因而適合采用負離子采集模式。在流動相體系下,采用質譜直接連續(xù)進樣的模式進行質譜條件的優(yōu)化,確定了目標化合物的錐孔電壓、碰撞電壓、離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、碰撞氣流量及定性定量離子等質譜參數,使每種目標化合物的離子化效率達到最佳,獲得的最優(yōu)質譜條件見表1。

2.2.2色譜條件的優(yōu)化

實驗采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)對氟蟲腈及其代謝物進行分離,通過調節(jié)流動相梯度,取得了較好的分離效果,4種目標化合物在7 min內即可完成有效分離。

流動相的組成不僅會影響目標化合物的保留時間和峰形,還會影響目標化合物的離子化效率,從而影響靈敏度。因目標化合物在負離子模式下采集,且氟蟲腈及其代謝物在中性條件下穩(wěn)定,因而沒有考慮將酸引入到流動相體系中。實驗考察了甲醇-水、乙腈-水兩種流動相體系在不同梯度洗脫程序下對目標化合物在分離度、峰形、靈敏度等方面的影響。結果顯示,乙腈-水作為流動相時無論從基線噪音、柱壓還是響應方面均優(yōu)于甲醇-水體系,且采用的提取劑為乙腈,因而選用乙腈-水作為流動相。

采用優(yōu)化的實驗方法,分別分析了陰性雞蛋樣品和陰性加標雞蛋樣品(見圖5)?？梢钥闯?目標化合物在實際樣品測定中不受樣品基質的干擾。

圖 5 陰性雞蛋樣品和加標雞蛋樣品(5 μg/kg)中氟蟲腈及其代謝物的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of fipronil and its metabolites in a negative sample and a spiked sample (5 μg/kg)

2.3 基質效應的考察

基質效應是殘留檢測中普遍存在的現象,本實驗通過基質匹配標準溶液與溶劑匹配標準溶液的響應強度之比進行基質效應的考察。儀器分析方面消除基質干擾的方法主要有采用基質匹配校準曲線、內標法校準、優(yōu)化梯度洗脫程序、稀釋上機液及減小進樣體積等。采用基質匹配校準曲線是消除基質干擾的常用方法,但實際檢測中存在一定困難;內標法尤其是同位素內標法是最受歡迎的消除基質效應的方法,但很多同位素內標價格昂貴且難以采購。因此本文重點考察了優(yōu)化梯度洗脫程序、稀釋上機液及減小進樣體積在減弱或消除基質效應方面的作用。

2.3.1梯度洗脫程序的優(yōu)化

因本實驗采用的是含高壓二元泵的超高效液相色譜儀,且所用色譜柱粒徑較小,對標準品進行分離時,通過調節(jié)洗脫梯度,氟蟲腈及其代謝物均可在1.5～3.0 min內出峰且峰形良好,但分析陰性加標樣品時發(fā)現目標化合物離子豐度比與標準品存在偏差,因而以陰性加標樣品進行分離,調節(jié)梯度洗脫程序,控制其在3.0～5.0 min時間段出峰,可減少基質干擾,且陰性加標樣品中目標化合物離子豐度比與標準品基本無差異。

2.3.2稀釋上機液及減小進樣體積

稀釋上機液是減小基質效應的一種有效方式[14],將加標樣品進行稀釋,若目標化合物的響應與稀釋前相比成比例減小,則基本不存在基質效應,若明顯偏大則存在基質抑制效應,明顯偏小則存在基質增強效應。本文采用乙腈提取,NaCl鹽析后氟蟲腈及其代謝物保留在乙腈層中,若直接上機不僅基質效應嚴重且存在一定的溶劑效應。采用加入同體積的水進行稀釋,在消除部分基質效應的同時也可消除溶劑效應,并且水的加入使有機類物質的溶解度有所降低,也可起到部分凈化作用。

進樣體積的減小也是消除基質效應的一種方式,李紅娥[15]發(fā)現減小進樣體積對部分農藥基質效應的消除有較好效果。實驗考察了不同進樣體積對消除基質效應的影響,發(fā)現稀釋一倍、進樣體積為3 μL時基質效應基本消除,具體數據見表2。

表 2 稀釋和進樣體積對氟蟲腈及其代謝物基質效應的影響Table 2 Influence of dilution and injection volume on the matrix effects of fipronil and its metabolitesAnalyteMatrix effects/%10 μL(dilution)10 μL(without dilution)3 μL(dilution)Fipronil107.8102.5103.4Fipronil desulfinyl115.9105.0103.0Fipronil sulfide123.5111.297.1Fipronil sulfone114.596.397.8

2.4 線性方程、相關系數和檢出限

為確認方法是否切實可行,本文參照GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》標準進行了方法學驗證。

對1.2節(jié)配制的系列混合標準工作液進行分析,以氟蟲腈及其代謝物峰面積(y)為縱坐標、對應的質量濃度(x, μg/L)為橫坐標，采用外標法繪制標準曲線,氟蟲腈及其代謝物在0.01～100 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(r2)均大于0.999(見表3)。向陰性樣品中逐級添加不同水平的混合標準工作液,將在較低水平下目標化合物峰形較好且S/N=3時的含量作為檢出限。結果表明,氟蟲腈及其代謝物的檢出限為0.10～0.43 μg/kg,完全滿足歐盟限量要求。

表 3 氟蟲腈及其代謝物的線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs of fipronil and its metabolites

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率及精密度

對陰性樣品進行3個水平(具體參照GB/T 27404-2008)的加標回收試驗。結果表明,在3個加標水平下,氟蟲腈及其代謝物的平均回收率為77.4% ～112.1% ,精密度為4.0% ～13.6%(n=6),具體數據見表4。

表 4 雞蛋樣品中氟蟲腈及其代謝產物的加標回收率和 精密度(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites in eggs (n=6)

2.6 實際樣品檢測

利用本文建立的方法對寧波市市售的20批雞蛋樣品進行檢測,包括養(yǎng)殖雞蛋和土雞蛋。結果表明,兩批土雞蛋樣品中檢出少量氟蟲腈砜殘留,含量分別為2.89 μg/kg和0.60 μg/kg,存在一定的安全風險。

3 結論

本文采用乙腈提取、NaCl鹽析的方法對雞蛋樣品進行前處理,建立了雞蛋樣品中氟蟲腈及其代謝物的超高效液相色譜-串聯質譜的測定方法。該法簡單、高效、靈敏,所用有機溶劑少,完全滿足歐盟及其他國家對氟蟲腈的限量要求,可用于實際樣品檢測。