許兵兵, 李曉敏, 張慶合, 朱維晃

(1. 西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院, 陜西 西安 710055; 2. 中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所, 北京 100029)

鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalate acid esters, PAEs)是一類有機污染物的總稱,常應用在塑料制品中以提高產(chǎn)品韌性[1]。PAEs與基體之間不是以共價鍵的形式存在[2],所以PAEs很容易遷移入空氣[3]、水[4]和土壤[5]等外界環(huán)境介質(zhì)中。研究表明，PAEs是一類內(nèi)分泌干擾物,產(chǎn)生和雌激素相似的作用,一些PAEs具有致癌特性[6,7]。其中,鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)根據(jù)其致癌程度被歸為2B類[8]。因此,美國環(huán)境保護署(US EPA)將PAEs列為優(yōu)先控制污染物;歐盟食品安全局(EFSA)規(guī)定鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)和DEHP的每日最大攝入量分別為0.01、0.5和0.05 mg/kg[9-11]。

表 1 16種塑化劑的名稱和性質(zhì)Table 1 Compound names and properties of the 16 phthalate acid esters (PAEs)

Kow: octanol/water partition coefficient; bp: boiling point.

歐洲、美國、加拿大和亞洲的嬰兒奶粉中均曾檢出部分鄰苯二甲酸酯類塑化劑成分,其中DEHP和DBP分別為34～281 μg/kg和15～77 μg/kg[12]。Fiernes等[13]在比利時農(nóng)場中亦發(fā)現(xiàn)8種常見PAEs,其中DEHP含量最高,為201.3～499.7 μg/kg。Lin等[14]發(fā)現(xiàn)塑料蓋包裝奶粉塑化劑含量高于金屬和玻璃蓋包裝。嬰兒奶粉中的塑化劑引入主要存在于兩個環(huán)節(jié):其一是水源,土壤以及牧草的塑化劑污染引入到鮮奶原料中[15];其二在奶粉的制作過程,比如采集奶源的聚氯乙烯(PVC)管、儲備罐等因為塑化劑的親油脂特性產(chǎn)生遷移[16]。

嬰兒配方奶粉作為嬰兒主要能量和營養(yǎng)來源,基體成分復雜,主要含有脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物,還具有少量維生素、礦物質(zhì)和核苷酸等成分[17]。因此,其中塑化劑的檢測難度較大。乳品基體中塑化劑的相關檢測方法以外標法為主,多采用液液萃取-固相萃取凈化結合質(zhì)譜檢測少數(shù)成分[18]。Yue等[19]使用反向遷移硅膠富集乳品中的PAEs成分;Farajzade等[20]通過液液微萃取濃縮PAEs,提高檢出限;Miclean等[21]將頂空固相微萃取應用于測定盒裝奶中6種PAEs,縮減了前處理步驟。但是外標法無法滿足更多PAEs組分的檢測要求,檢測結果的準確度和穩(wěn)定性較差。近年有文獻[22,23]報道以同位素內(nèi)標法結合液液萃取-固相萃取前處理,采用液相色譜-質(zhì)譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法測定奶粉中17種PAEs成分,與外標法相比,內(nèi)標法可以克服前處理環(huán)節(jié)的不足,應用于更多種PAEs的測定,但回收率和精密度仍不理想,主要因為嬰兒奶粉基體復雜,影響方法準確性。本研究嘗試比較氧化鋁/乙二胺-N-丙基硅烷(alumina/PSA)和PSA兩種不同玻璃固相萃取柱對16種PAEs(見表1)的凈化效果,探求奶粉基體樣品前處理中PAEs測定的影響因素,尋求測定嬰兒奶粉基體中PAEs的準確可靠的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7000B三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀和Agilent DB-5 MS UI氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(美國Agilent公司); N-EVAP 111氮吹儀,配有OASYSS水浴加熱裝置(美國Organomation公司); ME614S、ME36S天平(德國Sartorius公司); D-7700 Singen Transsonic Digitals超聲器(德國Elma公司); CR 21GⅢ高速冷凍離心機(日本日立公司); MX-S渦旋混合器(美國Scilogex公司);玻璃具塞離心管(15 mL),玻璃移液管(10 mL和1 mL), 24管固相萃取裝置(美國Supelco公司); 氧化鋁/PSA混合玻璃固相萃取柱(3 g/6 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司), PSA玻璃固相萃取柱(1 g/6 mL,北京迪科馬科技有限公司)。

氯化鈉購自美國Sigma公司;色譜級乙酸乙酯、二氯甲烷和質(zhì)譜級乙腈購自美國Fisher公司;色譜級正己烷購自德國Merck公司;丙酮購自美國Baker公司;鄰苯二甲酸酯二壬酯(DNP)標準品購自美國Chemservice公司,鄰苯二甲酸二丁酯溶液標準物質(zhì)(GBW10134)購于中國計量科學研究院,其余14種標準品購自德國Dr. Ehrenstofer公司,純度范圍98.0% ～99.9% 。16種氘代塑化劑內(nèi)標(PAEs-D4)的正己烷溶液的質(zhì)量濃度為100 μg/mL,購自北京迪科馬科技有限公司。

1.2 校準溶液的配制

16種PAEs純品用甲醇配制成100 μg/g標準儲備液及50 μg/g工作溶液。

16種氘代內(nèi)標儲備液(100 μg/mL)用乙醇稀釋,配制成50 μg/g工作溶液。均于4 ℃保存。

1.3 樣品前處理

準確稱取奶粉樣品0.5 g(精確至0.000 1 g)于15 mL玻璃離心管中,加入3 mL去離子水,渦旋振蕩30 s混合均勻,然后加入6 mL乙腈和1.0 g的NaCl后再渦旋振蕩2 min。在20 ℃、3 000 r/min條件下離心5 min后取上清液,于40 ℃下用氮氣吹干后,加3 mL正己烷復溶,待凈化。

PSA玻璃固相萃取柱使用5 mL丙酮和5 mL正己烷活化,將上述待凈化液上樣,再依次使用5 mL正己烷和5 mL正己烷-丙酮(60∶40, v/v)進行洗脫,流速控制為1 mL/min,收集兩次洗脫液于同一離心管中,在40 ℃的水浴中用氮氣吹干,加入1 mL二氯甲烷復溶后以GC-MS/MS測定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Agilent DB-5MS UI(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:50 ℃保持1 min,以20 ℃/min升溫至230 ℃,保持1 min,再以3 ℃/min升溫至240 ℃,保持1 min,然后以5 ℃/min升溫至300 ℃并保持10 min;載氣:氦氣,純度≥99.999% ;柱流速:1 mL/min,恒流;進樣體積:1 μL;進樣口溫度:300 ℃;進樣模式:不分流進樣。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電子轟擊離子(EI)源;離子源溫度:280 ℃;四極桿溫度:150 ℃; GC-MS/MS傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲:5 min;碰撞氣(N2)流速:1.5 mL/min,淬滅氣(He)流速:2.25 mL/min。采用多反應監(jiān)測(MRM)模式,每個塑化劑選取2個特征MRM反應,一個定量離子對,一個定性離子對;每種塑化劑內(nèi)標僅提供定量離子對信息(見表2)。

表 2 16種PAEs及PAEs-D4三重四極桿質(zhì)譜MRM條件參數(shù)Table 2 MRM parameters of 16 PAEs and corresponding PAEs-D4

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

圖 1 不同體積乙腈對嬰兒奶粉中16種塑化劑提取效率的 影響(n=5)Fig. 1 Effect of extraction volume of acetonitrile on the extraction rates of the 16 PAEs in infant formula (n=5) Extraction conditions: sample mass, 0.5 g; water volume, 3 mL; salt addition, 1.0 g NaCl.

1.5 同位素內(nèi)標法計算

準確稱取一定質(zhì)量PAEs和PAEs-D4工作溶液加入空白基質(zhì)溶液中,配制成16種PAEs分別為0.01～2.0 mg/kg的5個系列標準加標溶液。以PAEs的含量為橫坐標X(mg/kg),目標物定量離子對峰面積與其對應的氘代內(nèi)標定量離子對峰面積之比為縱坐標Y,進行線性回歸,計算線性方程和相關系數(shù)。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑用量的選擇

食品基體中塑化劑提取常用溶劑有正己烷和乙腈[24],但是正己烷對乳品進行提取會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,而乙腈既可以作為蛋白質(zhì)沉淀劑亦是提取溶劑,鹽析作用下可與水相形成穩(wěn)定分層,便于提取。因此,選擇乙腈作為提取溶劑。對乙腈的提取用量及乙腈提取的效率進行了比較研究(見圖1)。

4、6和9 mL乙腈的提取效率隨著乙腈體積的增加先增加后降低,6 mL時的提取效率最優(yōu)。說明小體積的提取溶劑不能充分提取PAEs,但是受離心管容量限制,大體積的乙腈與基體的混合不充分,也會導致提取效率偏低。16種PAEs的提取效率為22.6% ～83.7% , RSD為1.8% ～7.1% 。DEHP、DNOP和DNP的提取效率為22.6% ～43.3% ,其他13種PAEs為65.5% ～82.6% 。由于乙腈極性中等,高lgKow的弱極性PAEs更易于分配到脂肪中,所以提取效率偏低。Li等[25]亦報道了類似的結果,使用乙腈提取原乳中9種PAEs,平均回收率為65.2% ～98.3% ,提取效率隨著PAEs極性的減小而降低,說明乳品中脂肪的存在對于乙腈提取低極性PAEs的效率影響很大。若采用弱極性溶劑提高低極性PAEs的提取效率,脂肪共提取情況無法避免。Ren等[23]使用弱極性溶劑正己烷提取3種不同乳品基體,不僅出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,而且3種基體中強極性塑化劑DMP和DEP的提取效率僅為17.4% ～51.8% 。為了減小干擾和簡化操作,本文使用6 mL乙腈作為提取溶劑。

圖 2 氧化鋁/PSA固相萃取柱上不同洗脫溶劑對16種塑化劑回收率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of different elution solvents on the recoveries of the 16 PAEs on alumina/PSA SPE column (n=5)

2.1.2固相萃取柱的選擇和洗脫溶劑的優(yōu)化

因為塑化劑檢測的特殊性,需要避免使用塑料制品固相萃取柱。本試驗采用不同洗脫溶劑,考察了兩種玻璃固相萃取小柱(氧化鋁/PSA柱和PSA柱)對目標物回收率的影響。

考察氧化鋁/PSA固相萃取柱，該柱有淋洗過程,通過計算淋洗液穿透率,并未發(fā)現(xiàn)大量PAEs淋洗穿透現(xiàn)象(見表3),隨后對洗脫溶劑進行了優(yōu)化。比較了4組不同體積比的正己烷-乙酸乙酯混合液、2組不同體積比的正己烷-丙酮混合液和丙酮作為洗脫液的洗脫效果(見圖2), 7種不同洗脫液對DMP和DEP兩種強極性PAEs洗脫效果均不理想,DMP和DEP的回收率范圍分別為2.8% ～57.6%和35.0% ～87.5% 。造成上述結果的原因可能是氧化鋁作為一種強吸附劑,常用來吸附基體中的極性物質(zhì)[26],強極性PAEs也有較強吸附而難以洗脫,故導致DMP和DEP的回收偏低。夏冰等[27]采用氧化鋁類固相萃取對17種塑化劑進行分析,回收率低于20% 。

考察PSA固相萃取柱，該類型固相萃取柱沒有淋洗過程,直接對洗脫溶劑進行優(yōu)化。比較了3組不同體積比的正己烷-丙酮混合液、1組正己烷-乙酸乙酯混合液和乙腈的洗脫效果(見圖3)。在正己烷-丙酮(96∶4, v/v)混合液洗脫條件下,16種PAEs的回收率為21.4% ～112.6% ,其中極性較大的DMEP、DEEP和DPhP的回收率分別為23.6% 、42.3%和21.4% 。隨著丙酮體積比從4%上升至40% ,強極性塑化劑的回收率明顯提升,采用正己烷-丙酮(60∶40, v/v)混合液洗脫時效果最優(yōu),16種PAEs的回收率為79.1% ～120.1% ,且絕大多數(shù)PAEs回收率近100% 。正己烷-乙酸乙酯(50∶50, v/v)混合液和乙腈洗脫時的回收率分別為16.2% ～118.0%和54.3% ～100.6% 。正己烷-乙酸乙酯(50∶50, v/v)混合液與正己烷-丙酮(60∶40, v/v)混合液相比，極性偏小,所以很難將強極性PAEs洗脫下來,DPhP的回收率只有16.2% 。乙腈的極性偏大,對弱極性PAEs洗脫不完全,絕大多數(shù)PAEs的回收率低于80% 。PSA填料小柱可去除極性化合物,如碳水化合物、色素、有機酸類物質(zhì),該類型的柱子在塑化劑檢測中有較多應用,如植物飲料[27]和食用油[28]基體PAEs的凈化,同種類的PSA固相萃取柱的回收率范圍是78.9% ～98.7%[27]。

表 3 氧化鋁/PSA固相萃取柱對16種塑化劑的淋洗穿透率評估Table 3 Evaluation of the penetration of 16 PAEs onalumina/primary secondary amine (PSA) SPE column

圖 3 PSA固相萃取柱上不同洗脫溶劑對16種塑化劑回收率的影響(n=5)Fig. 3 Effect of different elution solvents on the recoveries of the 16 PAEs on PSA SPE column (n=5)

表 4 50 μg/kg水平下外標法和內(nèi)標法的回收率(n=5)Table 4 Recoveries of external and internal methods at 50 μg/kg spiked level (n=5)

考察了兩種不同類型固相萃取柱。氧化鋁/PSA混合柱采用7種洗脫液洗脫,除強極性的DMP和DEP回收率偏低,大多數(shù)PAEs的回收率超過120% ,說明該類型固相萃取柱基質(zhì)效應強,不適合奶粉基質(zhì)的PAEs分析。而PSA固相萃取柱以正己烷-丙酮混合液(60∶40, v/v)作為洗脫溶劑,16種PAEs的回收率較優(yōu),作為本實驗的最終凈化條件。

2.2 內(nèi)標法和外標法定量結果的對比

在50、250、500和1 000 μg/kg 4個水平進行回收率和重復性試驗,每個水平重復5次。4個水平上外標法測定的回收率和RSD分別為20.1% ～85.6%和1.1% ～5.3% ,弱極性PAEs回收效果較差。4個加標水平上同位素內(nèi)標法測定的回收率和RSD分別為96.1% ～104.0%和0.7% ～3.3% 。

以加標水平為50 μg/kg時的兩種定量方法進行對比(見表4)。外標法中DEHP、DNOP和DNP的回收率偏低,為20.1% ～40.4% ,其他13種PAEs的平均加標回收率為63.7% ～82.2% , RSD小于5.3% 。而同位素內(nèi)標法中16種PAEs的回收率則為96.1% ～104.0% , RSD小于3.3% 。相比于外標法,內(nèi)標法的方法回收率和精密度明顯提高。

本課題組[29]曾比較白酒中16種PAEs的定量方法,外標法回收率80.8% ～128.6% , RSD<12.9% ;內(nèi)標法回收率94.3% ～105.3% , RSD<6.5% 。內(nèi)標法回收率和精密度均有提高,與本文內(nèi)容一致。對于復雜基體而言,外標法會因為前處理過程或基質(zhì)效應而出現(xiàn)定值不準的情況,而同位素內(nèi)標與目標物性質(zhì)相似,可以最大程度消除前處理過程和基質(zhì)效應引入的誤差,提高定量的準確性。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

本研究采用同位素內(nèi)標法定量,以空白嬰兒奶粉基體匹配液配制5個不同水平的校準溶液。結果如表5所示,0.01～2.0 mg/kg范圍內(nèi)線性良好,相關系數(shù)(R2)均大于0.999。以信噪比(S/N)分別為3和10確定檢出限和定量限分別是0.15～2.50 μg/kg和0.50～8.33 μg/kg。相比于文獻[30]檢測奶粉樣品的檢出限12.91～126.05 μg/kg,提升15～25倍。Ren等[23]同樣以同位素內(nèi)標定量嬰兒奶粉中PAEs, 16種PAEs的定量限為15～30 μg/kg,與之相比本方法提高了7倍以上,食品中嚴格限量的DBP的定量限提升了20倍。

表 5 16種PAEs的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2), the limits of detection (LODs) and the limits of quantification (LOQs) of the 16 PAEs

Y: peak area ratio of PAE to PAE-D4;X: content, mg/kg.

圖 4 (a)空白嬰兒奶粉樣品經(jīng)PSA柱凈化后的全掃模式 色譜圖和(b)16種塑化劑空白奶粉基質(zhì)匹配校準液(200 μg/L)的多反應監(jiān)測模式色譜圖 Fig. 4 Chromatograms of (a) the blank infant formula sample purified by PSA column under scan mode and (b) 16 PAEs of the blank matrix-matched standard (200 mg/L) under MRM mode Peak Nos. are the same as those in Table 1.

2.4 固相萃取柱凈化效果分析

嬰兒奶粉基體成分復雜,不可避免在液液萃取環(huán)節(jié)出現(xiàn)干擾物共提取的情況,同時固相萃取柱也很難將不同特性干擾物一同去除。在樣品GC-MS/MS檢測過程中發(fā)現(xiàn),新襯管進樣150次左右會出現(xiàn)峰形拖尾和響應降低的現(xiàn)象,說明樣品因成分復雜未被充分凈化,存在雜質(zhì)污染色譜柱柱頭。使用全掃描模式對空白奶粉樣品進行檢測,發(fā)現(xiàn)25 min后有大量低極性和高沸點的雜質(zhì)出峰(見圖4a)。說明PSA固相萃取柱可以去除一定極性的脂肪酸和色素,但是對極性較弱的共提取物的去除效果并不理想。雖然這些干擾物出峰時間晚于16種PAEs,通過三重四極桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式可以很好地去除干擾,對目標物的檢測并沒有太大影響(見圖4b)。但是大量未被凈化的高沸點和弱極性雜質(zhì)進入進樣口和色譜柱,除了會對進樣口和色譜柱頭造成污染,長期積累也會危害質(zhì)譜系統(tǒng),這就需要定期更換進樣口襯管,清洗離子源。若想從根本上解決干擾物污染的問題,需要能夠特異性吸附目標物且有效去除干擾物的固相萃取柱,這就對固相萃取柱填料的要求較高。分子印跡技術可作為一種選擇,該技術可以很好地吸附目標物達到基體凈化的目的[31,32],但是因為技術的限制,一般對于單一物質(zhì)的吸附有良好效果,尚未有文獻將分子印跡技術應用于多組分的PAEs。另一種則是石墨化炭黑(GCB),該類型的填料在農(nóng)藥殘留測定中應用較多,根據(jù)文獻[33],該類型的固相萃取柱可以吸收具有平面苯環(huán)結構的分析物,因此應該可以應用在嬰兒奶粉復雜基體中特異性吸附含苯環(huán)結構的PAEs而達到凈化目的。但是商品化的GCB填料固相萃取柱沒有玻璃柱類型,自行裝填難度較大,本文暫未驗證其凈化效果。

3 總結

本文建立了一種液液萃取-固相萃取凈化測定嬰兒奶粉中16種鄰苯二甲酸酯類塑化劑殘留的方法。采用乙腈作為提取溶劑,其中低極性塑化劑提取效率偏低,但是同位素內(nèi)標法可以彌補低極性塑化劑提取效率偏低的不足。與外標法相比,精密度和穩(wěn)定性更好,可以達到更準確的定量要求。以PSA填料固相萃取柱凈化,可以較好地去除其中有極性的脂肪酸、有機酸、糖類和色素,但是對于一起被提取出來的低極性、高沸點雜質(zhì)的去除效果并不理想。雖然三重四極桿質(zhì)譜的MRM模式可以很好地去除干擾,但進樣口、色譜柱和質(zhì)譜還是會受到污染,影響塑化劑的響應。這也反映了嬰兒奶粉基體復雜,需要更加理想的固相萃取柱將其中所有的干擾物去除。