張 博，于振聲，周 濤，李建章

0 引言

骨質(zhì)疏松是臨床上老年人群高發(fā)的一種骨科疾病[1]，重度骨質(zhì)疏松可增加患者骨折風(fēng)險(xiǎn)，且骨折后常遷延不愈，給患者身體健康及生活質(zhì)量造成了巨大威脅。成骨能力受損與骨科疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]，探究成骨機(jī)制，尋找治療骨質(zhì)疏松及骨折修復(fù)新思路是目前臨床骨科亟待解決的關(guān)鍵性問題。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs)[3]因其具有較強(qiáng)的增殖能力及多向分化潛能，是目前骨組織工程領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的種子細(xì)胞。研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1b(Bone morphogenetic protein receptor 1b,BMPR1b)在骨形態(tài)發(fā)生蛋白促hBMSCs成骨事件中發(fā)揮重要作用[4]?；诖?，本研究旨在應(yīng)用RNA干擾(RNAi)[5]抑制BMPR1b基因表達(dá)，探討B(tài)MPR1b對hBMSCs成骨分化及Smads通路的影響，為闡明成骨分化機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 骨髓來源 經(jīng)本院倫理會批準(zhǔn)，取3例開放性骨折患者新鮮骨髓10 ml，所有患者了解本研究并同意簽署知情同意書，年齡21～26歲，均為男性。

1.1.2 主要試劑與儀器 新生小牛血清、DMEM培養(yǎng)基(杭州四季青生物公司)；hBMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物有限公司)；siRNA轉(zhuǎn)染試劑，購自于美國invitrogen公司；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)試劑盒(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)檢測試劑盒(北京中生生物工程有限公司)；Trizol、DEPC、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(日本TaKaRa公司)；紫外分光光度計(jì)(美國Beckman公司)；引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；紫外分光光度計(jì)(美國Beckman公司)；qRT-PCR儀ABI7700(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建BMPR1b-siRNA表達(dá)載體 應(yīng)用RNAi設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)針對Genbank中BMPR1b基因序列的特異siRNA，根據(jù)pGC-silencerTM U6/Neo/RNAi載體，構(gòu)建可在U6基因啟動子區(qū)域控制下產(chǎn)生短發(fā)卡狀載體質(zhì)粒pBMPR1b-GFPsi。經(jīng)雙酶切、PCR及測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建BMPR1b-siRNA表達(dá)載體。

1.2.2 hBMSCs細(xì)胞分離與鑒定 將10 ml新鮮骨髓置于無菌離心管中，采用密度梯度離心法分離hBMSCs細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察hBMSCs細(xì)胞生長情況及形態(tài)，選用第3代對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)成骨分化 細(xì)胞常規(guī)消化后，按照2×104/孔濃度接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，利用脂質(zhì)體Lipo fectamineTM2000將BMPR1b-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入hBMSCs(干擾組)，同時(shí)設(shè)置陰性對照組(轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒)及空白組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行。更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化培養(yǎng)2～21 d。

1.2.4 MTT檢測hBMSCs細(xì)胞增殖能力 利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測hBMSCs細(xì)胞增殖能力，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行，采用酶聯(lián)免疫分析儀，于波長490 nm處測定各個(gè)孔樣本吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.5 ALP活性檢測及茜素紅染色 于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、7、11天，采用堿性磷酸酶試劑盒及BCA蛋白檢測試劑盒檢測各組hBMSCs細(xì)胞ALP活性，其中ALP活性用ALP/總蛋白含量表示。于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天，進(jìn)行茜素紅染色檢驗(yàn)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.2.6 qRT-PCR檢測BMPR1b、ALP、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、Smad1、Smad4 mRNA表達(dá)水平 采用qRT-PCR檢測BMPR1b、成骨標(biāo)志基因ALP、OCN、OPN、Smads通路關(guān)鍵基因Smad1、Smad4 mRNA表達(dá)水平。

采用Trizol法分別提取3組hBMSCs細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA用以作為qRT-PCR反應(yīng)模板。qRT-PCR反應(yīng)選用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit定量擴(kuò)增體系進(jìn)行。反應(yīng)總體積10 μl：cDNA 0.8 μl，SYBR Primix Ex Taq 5.0 μl，引物1.0 μl，RNase H2O 2.2 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果采用2-△△CT方法處理，其中△△CT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)觀察組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組。引物序列見表1。

1.2.7 Western blot檢測ALP、OCN、OPN、Smad1、Smad4蛋白表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染后hBMSCs細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA Protein Assay Kit試劑盒定量蛋白濃度，以GAPDH為內(nèi)參，利用Western blot法檢測成骨標(biāo)志基因ALP、OCN、OPN、Smads通路關(guān)鍵基因Smad1、Smad4蛋白表達(dá)水平，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體操作嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行。

表1 qRT-PCR 擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs細(xì)胞分離與鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見，本研究分離所得原代hBMSCs單個(gè)核細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)均勻，趨于球形；第3代hBMSCs細(xì)胞形態(tài)均勻穩(wěn)定，成功分離培養(yǎng)hBMSCs細(xì)胞。見圖1。

2.2 三組BMPR1b mRNA表達(dá)水平比較 干擾組BMPR1b mRNA表達(dá)水平明顯低于陰性對照組及空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照組與空白組BMPR1b mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BMPR1b-siRNA轉(zhuǎn)染成功。見圖2。

圖1 hBMSCs倒置顯微鏡下觀察結(jié)果

2.3 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞增殖能力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMPR1b-siRNA可明顯抑制hBMSCs增殖能力，陰性對照組與空白組hBMSCs細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖2 三組BMPR1b mRNA表達(dá)水平比較

圖3 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞成骨分化能力的影響 ALP活性檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染BMPR1b-siRNA后，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、7、11天，干擾組ALP活性明顯低于陰性對照組與空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照組與空白組ALP活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。即：BMPR1b-siRNA可下調(diào)hBMSCs細(xì)胞ALP活性。見圖4。

圖4 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞ALP活性的影響

茜素紅染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染BMPR1b-siRNA后，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天，干擾組紅染鈣結(jié)節(jié)明顯少于陰性對照組與空白組(P<0.05)，陰性對照組與空白組茜素紅染色結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BMPR1b-siRNA可明顯降低hBMSCs細(xì)胞鈣化程度。見圖5。

2.5 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞ALP、OCN、OPN表達(dá)的影響 干擾組hBMSCs細(xì)胞ALP、OCN、OPN表達(dá)水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)，陰性對照組hBMSCs細(xì)胞ALP、OCN、OPN表達(dá)水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

2.6 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞Smad1、Smad4表達(dá)的影響 qRT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，干擾組hBMSCs細(xì)胞Smad1、Smad4表達(dá)水平明顯低于陰性對照組與空白組(P<0.05)，陰性對照組與空白組hBMSCs細(xì)胞Smad1、Smad4表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

3 討論

骨組織作為機(jī)體是一種不斷更新組織，主要由促進(jìn)骨組織形成的成骨細(xì)胞及促進(jìn)骨組織吸收的破骨細(xì)胞共同維持動態(tài)平衡，這種平衡一旦被破壞，則會引發(fā)骨質(zhì)疏松等疾病[6]。目前，骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病所致骨折、骨缺損、骨裂等已成為臨床迫切需要解決的問題之一[7-9]，增強(qiáng)機(jī)體骨再生能力是治療此類疾病的關(guān)鍵所在。

hBMSCs作為一種骨髓中非造血干細(xì)胞，因其具有易于體外擴(kuò)增，且可誘導(dǎo)成骨分化等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成理想的種子細(xì)胞而廣泛應(yīng)用于骨組織工程中[10-11]，在促進(jìn)骨再生、骨愈合等方面具有較高的臨床價(jià)值。因此，本研究選取hBMSCs為研究對象，探討B(tài)MPR1b對hBMSCs成骨分化及Smads通路的影響。hBMSCs成骨分化過程設(shè)計(jì)多條信號通路，其中包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)/TGFβ信號通路[12-13]。BMPR1b作為BMPⅠ型受體亞型，在整個(gè)BMP/TGFβ信號通路促成骨事件中起至關(guān)重要的承上啟下作用[14]。Graul-Neumann等[15]研究表明，BMPR1b純合子錯(cuò)義和無義突變與軟骨發(fā)育不了Grebe型發(fā)生密切相關(guān)。Carter等[16]研究表明，BMPR1b在強(qiáng)直性脊柱炎小鼠模型肢體芽細(xì)胞中表達(dá)呈明顯上調(diào)，推測其在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病過程中起重要作用。目前，國內(nèi)有關(guān)BMPR1b對hBMSCs成骨分化及Smads通路的影響研究甚少。

圖5 茜素紅染色結(jié)果(100×)

圖6 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞ALP、OCN、OPN表達(dá)的影響

注：A.qRT-PCR結(jié)果,B.Western blot結(jié)果。與空白組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

圖7 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細(xì)胞Smad1、Smad4表達(dá)的影響

注：A.qRT-PCR結(jié)果,B.Western blot結(jié)果。與空白組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

RNA干擾技術(shù)作為代替基因敲除技術(shù)的一種簡單、有效的遺傳工具，目前在探索基因功能、治療惡性腫瘤及傳染性疾病方面得到了廣泛應(yīng)用[17-18]。采用siRNA技術(shù)阻斷哺乳動物細(xì)胞中某一特定基因，具有高效性、基因序列特異性、持續(xù)時(shí)間長等特點(diǎn)[19]。本研究成功構(gòu)建了BMPR1b-siRNA特異性表達(dá)載體，并成功分離培養(yǎng)了hBMSCs細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，干擾組BMPR1b mRNA表達(dá)水平明顯低于陰性對照組及空白組，陰性對照組與空白組BMPR1b mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示所構(gòu)建BMPR1b-siRNA載體成功干擾了hBMSCs細(xì)胞BMPR1b基因表達(dá)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMPR1b-siRNA可明顯抑制hBMSCs增殖能力，說明BMPR1b基因表達(dá)被阻斷后，hBMSCs增殖能力明顯下降，提示BMPR1b在hBMSCs增殖過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，BMPR1b-siRNA可下調(diào)hBMSCs細(xì)胞ALP活性，茜素紅染色結(jié)果顯示，BMPR1b-siRNA可明顯降低hBMSCs細(xì)胞鈣化程度，說明BMPR1b被阻斷后，hBMSCs成骨分化能力被明顯阻斷，BMPR1b在誘導(dǎo)hBMSCs細(xì)胞成骨分化過程中可能發(fā)揮正向調(diào)控作用。ALP基因作為成骨細(xì)胞分化早期標(biāo)志物[20-21]，OPN為成骨分化中晚期標(biāo)志物[22]，OCN是成骨細(xì)胞最終分化完成的重要生化指標(biāo)[23]。BMPR1b-siRNA可明顯下調(diào)ALP、OCN、OPN表達(dá)，證實(shí)BMPR1b在成骨分化過程中發(fā)揮重要正向調(diào)控作用，干擾BMPR1b表達(dá)可抑制hBMSCs細(xì)胞成骨分化。Smads家族是BMP骨形成信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要介質(zhì)蛋白[24]，Smad1、Smad4是Smads家族重要成員，二者在破骨細(xì)胞分化過程中具有重要作用[25-26]。本研究結(jié)果表明，BMPR1b-siRNA可明顯下調(diào)Smad1、Smad4表達(dá)，提示BMPR1b與Smad1、Smad4之間可能存在某種調(diào)控作用，共同參與成骨分化過程，其所涉及具體信號通路傳導(dǎo)，值得后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

綜上所述，BMPR1b-siRNA可明顯抑制hBMSCs細(xì)胞成骨分化，推測其機(jī)制可能與抑制Smads通路有關(guān)。BMPR1b可能在骨質(zhì)疏松、骨不連、骨折不愈合等骨組織疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，BMPR1b有望成為骨代謝等疾病治療新靶點(diǎn)，具有較高的研究價(jià)值。