吳 靖，續(xù) 蕾

0 引言

五味子乙素(Schisandrin B)是一種來源于中草藥五味子的活性物質，屬于脂素類物質。前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素具有廣泛的藥理活性，其中以抗炎效果較為顯著[1-3]。研究還證實，五味子乙素對短暫性局部腦缺血大鼠的神經細胞具有保護作用[4]，能改善中樞神經系統(tǒng)的功能。Traf6/TAK1信號通路的活化在炎癥反應中起著重要的作用。Traf6作為一種銜接蛋白可以介導LTR4信號的傳導，最終激活NF-κB信號通路，誘導炎癥的發(fā)生[5-6]。為了探討五味子乙素對神經細胞的炎癥反應是否具有保護作用，本文以LPS作用小神經膠質細胞BV-2誘導神經炎癥損傷模型，通過觀察細胞增殖抑制率、炎癥因子及炎癥相關蛋白的表達，探究五味子乙素對BV-2細胞炎癥損傷的保護效應及其作用機制。

1 材料及方法

1.1 材料 小神經膠質BV-2細胞購買于武漢巴菲爾生物科技有限公司；五味子乙素(北京博奧森生物科技有限公司，純度98%，批號：61281-37-6)；脂多糖LPS(美國Sigma公司，批號：A0267975)；CCK8試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，批號：59-20061)；ELISA試劑盒(深圳寶安康生物科技有限公司，批號：HSP-70)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(長沙贏潤生物科技有限公司，批號：P0006)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司，批號：P0012A)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：HS30809)；β-actin、iNOS、COX-2、Traf6、TAK1及p-TAK1一抗均購自英國Abcam公司；對應二抗購自上海谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 酶標儀(美國寶特公司，型號：ELX808IU)；單人超凈臺(廣州瀘瑞明儀器有限公司，型號：SW-CJ-1C)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號：HERAcell 2401)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD，批號：LI-COR ODYSSEY)。

1.3 BV-2細胞培養(yǎng) 將單人超凈工作臺及相關實驗物品紫外光照30 min，復蘇BV-2細胞進行傳代培養(yǎng)，細胞用1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，1%的100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，培養(yǎng)3～4 d后進行傳代培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞增殖實驗 取對數期細胞進行消化、離心、重懸、計數后，取適量細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，分為空白對照組(C組)、LPS誘導模型組(M組)、LPS+10 μmol/L五味子乙素組(SL組)、LPS+20 μmol/L五味子乙素組(SM組)、LPS+40 μmol/L五味子乙素組(SH組)，培養(yǎng)24 h后吸凈舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μl含10 μl CCK9試劑的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后在波長450 nm處的酶標儀中測定每孔吸光度值。

1.5 細胞上清IL-6、TNF-α水平檢測 取對數期細胞進行消化、離心、重懸、計數后，取適量細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，細胞分組、培養(yǎng)按“1.4”項下操作，收集細胞上清，按照ELISA試劑盒操作說明書進行IL-6、TNF-α水平檢測。

1.6 免疫印跡檢測蛋白水平 取對數期細胞進行消化、離心、重懸、計數后，取適量細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，細胞分組、培養(yǎng)按“1.4”項下操作，收集細胞，裂解，離心，收集上清，檢測蛋白濃度。然后每孔上樣50 μg，進行電泳分析，轉膜，封閉，孵育一抗過夜，洗膜，孵育二抗，洗膜及蛋白表達分析。

2 結果

2.1 五味子乙素對BV-2細胞增殖的作用 由圖1可見，LPS能明顯抑制BV-2細胞增殖，降低細胞相對存活率，與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在經過不同劑量的五味子乙素(10、20、40 μmol/L)干預后，BV-2細胞的相對存活率明顯升高，與M組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細胞相對存活率升高，見圖1。

圖1 五味子乙素對BV-2細胞增殖的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

2.2 五味子乙素對BV-2細胞炎癥因子釋放的影響 由表1可見，LPS能夠明顯誘導BV-2細胞釋放炎癥因子IL-6、TNF-α，與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在經過不同劑量的五味子乙素處理后，BV-2細胞上清中IL-6、TNF-α的水平顯著降低，與M組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細胞上清中IL-6、TNF-α的水平減少，見表1。

表1 五味子乙素對BV-2細胞炎癥因子釋放的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

2.3 五味子乙素對BV-2細胞中炎癥相關蛋白表達量的影響 由圖2可見，LPS能夠明顯誘導BV-2細胞炎癥相關蛋白iNOS、COX-2的上調，與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在經過不同劑量的五味子乙素處理后，BV-2細胞iNOS、COX-2水平顯著降低，與M組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細胞iNOS、COX-2的表達量降低。

圖2 五味子乙素對iNOS和COX-2蛋白表達水平的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

2.4 五味子乙素對BV-2細胞中Traf6/TAK1信號通路的影響 由圖3可見，LPS能夠明顯誘導BV-2細胞中Traf6、TAK1磷酸化水平的上調，與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在經過不同劑量的五味子乙素處理后，BV-2細胞中Traf6、TAK1磷酸化水平顯著降低，與M組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細胞中Traf6、TAK1磷酸化水平降低。

3 討論

目前，關于阿爾茨海默癥(AD)發(fā)病機制的闡述較為淺顯，而慢性炎癥反應是誘導神經損傷的主要病因之一。BV-2細胞是腦組織中主要的免疫效應細胞，當受到刺激因素作用時會被異常激活，其作用主要表現(xiàn)在兩個方面：其一，表現(xiàn)出巨噬細胞細胞功能吞噬Aβ，降低神經團塊的形成；其二，其產生的大量炎癥因子誘發(fā)神經元的損傷，導致神經變性[7-9]。因此，干預BV-2細胞的活化或抑制其炎癥因子的釋放，可能對預防AD及改善該疾病的進展具有重要意義。

圖3 五味子乙素對Traf6/TAK1信號通路活化的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

轉錄生長因子-β活化激酶1(TAK1)受多種因素的刺激，可以介導胞外信號的傳導，TGF-β、TLR、CD4及B細胞受體等細胞因子介導的信號均可由TAK1的磷酸化發(fā)揮相應的生物學效應[10]。研究表明，Traf6表達水平上升可促使TAK1的磷酸化，進而誘導細胞炎癥、凋亡及氧化應激損傷的發(fā)生[11]。并且Trfa6/TAK1通路可介導TLR4信號傳導激活NF-κB炎癥通路[5-6]。本實驗中，采用LPS誘導炎癥細胞模型，經過不同濃度五味子乙素干預后，可明顯降低炎癥因子IL-6、TNF-α的釋放，還抑制了炎癥相關蛋白iNOS、COX-2的表達，并且表現(xiàn)出濃度依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能夠通過調節(jié)Trfa6/TAK1信號通路，降低活化的BV-2細胞的炎癥反應，降低炎癥因子的產生，從而對慢性炎癥性神經損傷具有保護作用。

綜上所述，本實驗從神經炎癥角度探討了五味子乙素對神經細胞損傷的保護作用。五味子乙素可能通過抑制Traf6/TAK1通路活化對BV-2細胞激活進行調控。本文闡述了該化合物的抗炎作用機制，可能為AD等神經退行性疾病治療提供新的思路，也為五味子乙素的臨床應用提供新的方向。