袁逾喆，張忠泉，孫慶紅，聶建軍

0 引言

前列腺癌是臨床常見的男性生殖系統(tǒng)上皮性惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率較高，有報(bào)道，僅2010年美國前列腺癌的新增病例為21.8萬例[2]，我國前列腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方國家，但隨著生活方式的西化和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國前列腺癌的發(fā)病率逐年攀升，2012年我國腫瘤登記地區(qū)前列腺癌的發(fā)病率為9.92/100 000，居于男性惡性腫瘤的第6位[3]，預(yù)計(jì)到2050年，前列腺癌的發(fā)病率將增加2.5倍[4]。前列腺癌的致死率較高，嚴(yán)重威脅男性患者身體健康和生命安全。因此，探究安全高效的治療前列腺癌的藥物是醫(yī)學(xué)工作者研究的重點(diǎn)。

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種重要的植物抗毒素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎的作用[5]。近年研究表明，Res在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[6]。本研究以人前列腺癌系PC-3為研究對(duì)象，探究白藜蘆醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲和凋亡的影響及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人前列腺癌系PC-3由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.1.2 主要試劑與材料 DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；TRIzol reagent購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量試劑盒購自英國NEB公司；鼠抗人MMP-9多克隆抗體購自艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板和Transwell小室購自美國Corning公司；3K15超低溫離心機(jī)購自德國Sigma公司；奧林巴斯熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Biosciences FACSAriaⅢ流式細(xì)胞儀購自美國BD；熒光定量PCR儀器購自德國Eppendorf；引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將購買的人前列腺癌PC-3解凍復(fù)蘇，加入2～3 ml胰蛋白酶液消化處理后，制成細(xì)胞懸浮液，按細(xì)胞數(shù)目1×106/ml接種于DMEM培養(yǎng)基中(10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿瓶底85%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化處理后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)和細(xì)胞凍存。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 取凍存的人前列腺癌PC-3，加入2 ml 0.25%的胰蛋白酶液消化處理，并制成單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106/ml接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μl/孔)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)，將細(xì)胞分成5組，每組重復(fù)8孔，命名為對(duì)照組、Z-DEVD-FMK組、Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組。Z-DEVD-FMK組：用100 μmol/L Z-DEVD-FMK培養(yǎng)細(xì)胞；Res低劑量組：在Z-DEVD-FMK組基礎(chǔ)上，用20 μmol/L Res培養(yǎng)細(xì)胞；Res中劑量組：在Z-DEVD-FMK組基礎(chǔ)上，用60 μmol/L Res培養(yǎng)細(xì)胞；Res高劑量組：在Z-DEVD-FMK組基礎(chǔ)上，用100 μmol/L Res培養(yǎng)細(xì)胞；對(duì)照組：加入等量的DSMO，每組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)人前列腺癌PC-3中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平 用TRIzol reagent提取人前列腺癌PC-3的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)成cDNA，根據(jù)NCBI上提交的Caspase-3(GI:16516816)和PARP-1(GI:156523967)的理論序列設(shè)計(jì)引物，Caspase-3：上游引物F1：5′-GGAAGCGAATCAATGGACTC-3′，下游引物R1：5′-CTCAGAAGCACACAAACAAAA-3′；PARP-1：上游引物F2：5′-AGGCATCAGCAATCTATCAGG-3′，下游引物R2：5′-GAGAAGGCATCTGCATTTTTTAATC-3′；以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系：5×緩沖液10 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，上游引物F 2 μl，下游引物R 2 μl，10 mmol dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl；反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：63 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)讀取光密度(D)值，采用最大二階導(dǎo)數(shù)法(2-△△Ct)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算Caspase-3和PARP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Transwell小室檢測(cè)人前列腺癌PC-3侵襲能力 用DMEM培養(yǎng)基將Matrigel膠稀釋至1 mg/ml，然后取40 μl均勻鋪于Transwell小室上室，37 ℃靜置30 min。取各組人前列腺癌PC-3，消化處理后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106/ml，按每孔100 μl加入到Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液清洗細(xì)胞，每孔加入500 μl 95%酒精固定15～20 min，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min后，用棉簽擦拭未穿膜細(xì)胞，風(fēng)干后置于顯微鏡觀察，并記錄侵出小室細(xì)胞數(shù)目，以此作為評(píng)判細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。

1.2.5 Hoechst33258染色檢測(cè)人前列腺癌PC-3凋亡情況 取各組生長良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿瓶底的80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，棄去固定液，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2～3次，加入500 μl Hoechst33258染液，染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞核著色情況。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人前列腺癌PC-3凋亡情況 培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2～3次后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞2～3 min，加入75%乙醇于4 ℃下過夜固定細(xì)胞，用PBS漂洗細(xì)胞，置于超低溫離心機(jī)2 000 r/min離心10 min，棄去上清，此過程重復(fù)2～3次；加入10 μl RNA酶在37 ℃下孵育30 min，用10 μl PI進(jìn)行染色，然后在黑暗中4 ℃孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，使用ModFit LT軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞百分比計(jì)算。

1.2.7 Western blot檢測(cè)PC-3細(xì)胞中MMP-9表達(dá)情況 加入細(xì)胞裂解液提取人前列腺癌PC-3細(xì)胞總蛋白，將蛋白樣品進(jìn)行加熱煮沸和離心。以GAPDH為內(nèi)參，取20 μl蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，滴加鼠抗人MMP-9多克隆抗體，置4 ℃下過夜，滴加二抗，37 ℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對(duì)SDS-PAGE電泳圖目的條帶進(jìn)行掃描，分析MMP-9的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)人前列腺癌PC-3中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Z-DEVD-FMK組PC-3細(xì)胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細(xì)胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平顯著提高，呈劑量依賴性，結(jié)果見表1。

表1 各組人前列腺癌PC-3中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平比較

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

2.2 Transwell小室檢測(cè)人前列腺癌PC-3侵襲能力 Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示，Z-DEVD-FMK組PC-3細(xì)胞侵襲能力高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細(xì)胞侵襲能力低于對(duì)照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，PC-3細(xì)胞侵襲能力顯著降低，呈劑量依賴性，結(jié)果見表2。

表2 各組侵出Transwell小室的人前列腺癌PC-3細(xì)胞數(shù)目

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

2.3 Hoechst33258染色檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡情況 熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Z-DEVD-FMK組細(xì)胞核染色質(zhì)均勻分布，呈現(xiàn)均勻的弱藍(lán)色熒光，經(jīng)Res處理后，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，隨著Res劑量的增加，發(fā)出亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，結(jié)果如圖1所示。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人前列腺癌PC-3凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，Z-DEVD-FMK組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，PC-3細(xì)胞凋亡率顯著提高，呈劑量依賴性，結(jié)果見表3。

表3 各組人前列腺癌PC-3凋亡率比較

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

圖1 Hoechst33258染色檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡情況

2.5 Western blot檢測(cè)PC-3細(xì)胞中MMP-9表達(dá)情況 Z-DEVD-FMK組PC-3細(xì)胞中MMP-9表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細(xì)胞中MMP-9表達(dá)水平低于對(duì)照組和Z-DEVD-FMK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著Res劑量增加，MMP-9表達(dá)水平顯著降低，呈劑量依賴性，結(jié)果見表4。

表4 各組PC-3細(xì)胞中MMP-9相對(duì)表達(dá)量

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與Z-DEVD-FMK組比較，P<0.05；$與Res低劑量組比較，P<0.05；&與Res中劑量組比較，P<0.05

3 討論

前列腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高的特點(diǎn)，其在中國的發(fā)病率僅次于肺癌，居于第2位[7]，嚴(yán)重影響男性患者的身體健康和生命安全[8]。目前，臨床治療前列腺癌的主要方法有手術(shù)治療和放、化療[9-10]，放、化療具有很大的不良反應(yīng)，給患者帶來極大的痛苦，對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的中晚期前列腺癌患者，手術(shù)治療不能有效切除病灶，因此，嚴(yán)重影響患者治愈率及預(yù)后[11-12]。有報(bào)道，局限性前列腺癌的5年生存率為100%，而轉(zhuǎn)移性前列腺癌的5年生存率為31%[13]，因此，探究能夠抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的藥物是提高前列腺癌患者生存率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Res是一種多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、藜蘆和鳳梨等70多種植物中，其中以葡萄皮中Res的含量最高，約為50～100 μg/g[14]。研究表明，Res具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎和神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)功能[15]。李偉等[16]研究表明，Res能夠通過調(diào)控表皮生長因子受體的表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1和BxPC-3增殖，同時(shí)通過下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中促存活蛋白Mcl-1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。孫大鵬等[17]研究表明，Res能夠下調(diào)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中c-PLIP蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和侵襲。鐘鳴駿等[18]研究表明，Res能夠抑制皮膚鱗狀癌細(xì)胞Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13增殖，將其細(xì)胞周期阻滯在G1期。謝進(jìn)東等[19]用不同濃度的Res處理去勢(shì)抵抗型前列腺癌細(xì)胞系22RV1，結(jié)果表明，Res通過下調(diào)去勢(shì)抵抗型前列腺癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)去勢(shì)抵抗型前列腺癌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以上研究均提示，Res在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。

本研究表明，Res組PC-3細(xì)胞侵襲能力顯著低于對(duì)照組，Res組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Res能夠抑制人前列腺癌PC-3細(xì)胞的侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Res在人前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，但其作用機(jī)制尚未完全明確。MMP-9在細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中發(fā)揮著重要的作用，與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，張莉等[20]采用免疫組化檢測(cè)不同前列腺癌組織中MMP-9的表達(dá)水平，同時(shí)采用Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果表明，MMP-9的表達(dá)水平與前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān)。本研究表明，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細(xì)胞中MMP-9表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和Z-DEVD-FMK組，且隨著Res劑量增加，MMP-9表達(dá)水平顯著降低，呈劑量依賴性，提示Res能夠通過下調(diào)MMP-9表達(dá)水平抑制PC-3細(xì)胞侵襲。

Caspase-3是腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白，Hay等[21]研究表明，重組蛋白IAP可以下調(diào)Caspase-3或Caspase-7的表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡。PARP-1是Caspase-3下游的信號(hào)分子，在大量自由基和氧化劑存在的情況下會(huì)引發(fā)PARP-1過度激活，引起ATP的過度消耗，引發(fā)細(xì)胞凋亡[22]。本研究以Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK處理的細(xì)胞為陽性對(duì)照，探究Res對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明，Res低劑量組、Res中劑量組、Res高劑量組PC-3細(xì)胞中Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和Z-DEVD-FMK組，且隨著Res劑量增加，Caspase-3和PARP-1 mRNA表達(dá)水平顯著提高，呈劑量依賴性，提示Res通過激活PC-3細(xì)胞中Caspase-3和PARP-1的表達(dá)來影響PC-3細(xì)胞侵襲和凋亡。

綜上所述，白藜蘆醇能夠上調(diào)Caspase-3和PARP的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，為前列腺癌的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。