黃曉莉，吳 坤，趙莎莎

（1．山東大學(xué)齊魯醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，山東濟(jì)南250012；2．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，黑龍江 哈 爾濱 150081）

維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的第6位羥基被琥珀酸所替代，并脫去1個(gè)水分子形成的酯類化合物。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)VES作為一種潛在的腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療劑，能夠通過(guò)死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑、線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑、MAPK、氧化應(yīng)激等機(jī)制誘導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[1-3]。近年來(lái)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作為關(guān)鍵的信號(hào)分子和信號(hào)途徑在抗腫瘤研究中越來(lái)越受到重視[4-5]。ERS發(fā)生時(shí)，細(xì)胞可通過(guò)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)來(lái)提高自身的生存能力，但是若應(yīng)激刺激過(guò)強(qiáng)或過(guò)久，未折疊蛋白反應(yīng)反而會(huì)激活相應(yīng)的凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)VES能夠誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，并能夠增加SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS的含量[3，6-7]。本文擬探討VES處理人胃癌細(xì)胞后淬滅ROS對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，旨在深入闡明VES誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中ROS與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

VES和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購(gòu)自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulative protein，GRP78)多克隆抗體和C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)單克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司；β-actin購(gòu)自Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

MCO-17A型CO培養(yǎng)箱購(gòu)于Sanyo公司；AllegraTM

2 64R低溫高速離心機(jī)和DUR 640核酸蛋白分析儀均購(gòu)于Beckman公司；C1Si型激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自上海衡橋儀器有限公司；FACScan (Becton Dickinson)型流式細(xì)胞儀購(gòu)于貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司；分子雜交箱購(gòu)于Amersham Life Science；ChemilmagerTM4000數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于Alpha Innotech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自北京腫瘤研究所，細(xì)胞在含有10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。VES溶于無(wú)水乙醇中，配制為10 mg/mL的儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。處理細(xì)胞時(shí)用2% RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成20 μg/mL，含有0.1%乙醇的RPMI- 1640培養(yǎng)液為溶劑對(duì)照，并設(shè)有VES處理組、NAC處理組和NAC+VES聯(lián)合處理組。

1.3 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量

不同濃度(1、5、10和20 mmol/L)NAC作用胃癌SGC-7901細(xì)胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理12 h，無(wú)血清培養(yǎng)液與2′，7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(2′，7′-dichlorodihydro-fluorescein diacetate， DCFH-DA) 以1∶ 1 000 比例混合，使DCFH-DA終濃度為10 μmol/L。緩慢沖洗細(xì)胞后，加入稀釋好的DCFH-DA溶液，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔5 min輕輕搖勻1次。PBS緩慢沖洗細(xì)胞3次后，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后生成二氯二氫熒光素(dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以使無(wú)熒光的DCFH氧化生成有熒光的二氯熒光黃(diemorofluorescein，DCF)，激光共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn)綠色熒光，ROS含量越高則熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。另將20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細(xì)胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理細(xì)胞12 h，經(jīng)DCFH-DA染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，方法同上。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè)mRNA表達(dá)

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細(xì)胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理15 h后，收集細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列：β-actin，上游5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA A-3′，下游5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為540 bp；GRP78，上游5′-GATAATCAACC AACTGTTAC-3′，下游5′-GTATCCTCTTCACCAGTTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為577 bp；CHOP，上游5′-GCACCT CCCAGAGCCCTCACTCTCC-3′，下游5′-GTCTACTCC AAGCCTTCCCCCTGCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為422 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙啶染色、拍照，并進(jìn)行灰度值分析。

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細(xì)胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理24 h后，收集細(xì)胞，用冷的PBS沖洗2次，懸浮于細(xì)胞裂解液中，冰上裂解30 min，采用Bio-Rad DC Protein Assay測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，等量蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h后，分別加入一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG二抗，孵育后加顯色底物，數(shù)字成像儀掃描成像，并進(jìn)行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。通過(guò)ANOVA方差分析進(jìn)行組間比較，各組之間的兩兩比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察胃癌SGC-7901細(xì)胞ROS水平

激光共聚焦顯微鏡觀察見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，20 μg/mL VES使細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高，而經(jīng)不同濃度NAC預(yù)處理之后，與單純VES處理組相比，10 mmol/L NAC預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)ROS開始降低，20 mmol/LNAC預(yù)處理組降低最為明顯。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS水平

見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，20 μg/mL VES明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，而20 mmol/L NAC預(yù)處理能明顯降低ROS的產(chǎn)生，與激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)的結(jié)果一致，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS水平

2.3 淬滅細(xì)胞ROS對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78和CHOP mRNA表達(dá)的影響

見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，20 μg/mL VES能夠提高GRP78和CHOP mRNA水平，而20 mmol/L NAC顯著抑制VES對(duì)GRP78和CHOP mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用。

2.4 淬滅細(xì)胞ROS對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78和CHOP蛋白表達(dá)的影響

見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，20 μg/mL VES能夠提高胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)GRP78和CHOP蛋白水平，而20 mmol/L NAC顯著抑制VES對(duì)GRP78和CHOP蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞重要的亞細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)的合成、加工、運(yùn)輸及脂類的合成和儲(chǔ)存等重要生理功能。各種生理和病理刺激條件下，未折疊或折疊錯(cuò)誤的蛋白積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)損傷嚴(yán)重，則激活相應(yīng)的凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。ROS產(chǎn)生增加或抗氧化防御系統(tǒng)受到損傷時(shí)，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，也可以引起細(xì)胞凋亡[4]。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)糖尿病腎病小鼠管狀上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程中，ROS發(fā)揮了非常重要的作用[8]。也有報(bào)道顯示亞硒酸鈉誘導(dǎo)人急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞和脫氫甲基還氧醌霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是氧化應(yīng)激的下游事件[9-10]。另有研究卻發(fā)現(xiàn)葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并未依賴氧化應(yīng)激，相關(guān)研究結(jié)論并不一致[11]。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VES能夠誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，并能夠增加SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量，本文則探討VES處理人胃癌細(xì)胞后淬滅ROS 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

圖3 NAC對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響及灰度值分析

圖4 NAC對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響及灰度值分析

NAC作為一種巰醇化合物，是細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的前體，可以促進(jìn)谷胱甘肽合成，增強(qiáng)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的活性，對(duì)氧自由基反應(yīng)直接作用并促進(jìn)解毒，是一種非常強(qiáng)的抗氧化劑，可以抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[12]。本研究中20 μg/mL VES能夠顯著促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，20 mmol/L NAC預(yù)處理細(xì)胞2 h可以明顯抑制ROS的產(chǎn)生，驗(yàn)證了NAC清除ROS的作用，并通過(guò)探討VES處理胃癌細(xì)胞后NAC對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，進(jìn)而闡明VES誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中ROS與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。

GRP78分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，可識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白，協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、伸展、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，幫助未折疊蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性分子伴侶的功能[13]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性轉(zhuǎn)錄因子。在非應(yīng)激狀態(tài)下，CHOP表達(dá)水平很低；發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，CHOP表達(dá)水平顯著增加[14]。本研究發(fā)現(xiàn)20 μg/mL VES能夠顯著誘導(dǎo)GRP78和CHOP mRNA 及蛋白的表達(dá)，與前期結(jié)果一致。而通過(guò)NAC淬滅胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS后，20 μg/mL VES對(duì)GRP78和CHOP mRNA及蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用均被顯著抑制。因?yàn)镚RP78和CHOP都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激非常特異的信號(hào)分子，所以本研究結(jié)果提示VES誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能依賴于ROS的生成。Kadara等[15]同樣發(fā)現(xiàn)，維胺脂引起人頭頸癌細(xì)胞ROS的形成可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)維生素C和NAC等抗氧化劑能夠抑制牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)引起的腎近端小管上皮細(xì)胞GRP78水平上升[16]。同樣也有與本研究結(jié)果不同的報(bào)道?？寡趸瘎┚S生素C和維生素E并不能逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖作用人臍帶上皮細(xì)胞引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17]。本研究?jī)H初步探討VES作用胃癌細(xì)胞后淬滅活性氧對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，詳細(xì)的機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。