肖偉莉，王雪梅，閆廣義，葉 鳳，文國錦

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 安徽 合肥 230601)

β-熊果苷(β-arbutin)、VC乙基醚(ethyl ascorbic acid )、煙酰胺(nicotinamide)是目前美白護膚品中常用的水溶性美白活性成分，其美白機理各不相同.β-熊果苷主要通過抑制黑色素細胞中的絡(luò)氨酸酶，阻斷多巴及多巴醌的合成來抑制黑色素生成[1].VC乙基醚作為維生素C的衍生物，可以阻止黑色素的氧化過程，抑制黑色素形成，通過影響黑色素形成的多個環(huán)節(jié)，還原黑色素中間體和黑色素的聚合物，減少多巴和多巴醌類物質(zhì)形成，抑制黑色素的產(chǎn)生[2-3].煙酰胺作為B族維生素的一員，有別于傳統(tǒng)的美白成分，能影響黑素細胞中物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致黑素細胞中黑色素合成能力減弱，有效抑制黑色素向角質(zhì)細胞傳遞[4].當(dāng)有部分黑色素已不可避免地達到表層皮膚后，煙酰胺又能通過加速皮膚細胞的更新速度從而促進含有黑色素的細胞脫落，從內(nèi)到外實現(xiàn)改善膚質(zhì)、凈白肌膚的效果[5].

無論其作用機理如何，美白劑首先要滲透進入皮膚才能發(fā)揮其美白功效.因此，研究美白活性組分的透皮情況對評價其美白效果有著重要的意義.目前經(jīng)皮滲透實驗主要用于藥物的吸收，有關(guān)美白劑的透皮實驗研究報道極少.

化妝品的經(jīng)皮過程與藥物的主要區(qū)別在于：多數(shù)藥物是透皮后通過毛細血管作用進入體循環(huán)，在作用部位積聚[6]；大多數(shù)化妝品功能性成分需要進入皮膚，按產(chǎn)品的有效性作用于皮膚表面或進入表皮或真皮，并在該部位積聚和發(fā)揮作用，不需要透過皮膚進入體循環(huán)[7].筆者參照經(jīng)皮給藥實驗的方法，采用高效液相色譜法通過測定累積透過率與滯留率，對上述3種美白劑進行體外透皮研究.

1 儀器與材料

安捷倫高效液相色譜(Agilent HPLC 1260)，配有自動進樣器和二極管陣列檢測器(DAD)，美國安捷倫科技有限公司；UV-1750紫外-可見分光光度計，日本島津公司；AB104-N 電子分析天平，精度0.000 1 g，上海梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)；TP-6型智能透皮試驗儀，天津市鑫洲科技有限公司；電熱恒溫干燥器，上海精密科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇金城國盛實驗儀器廠；JK-3200B型超聲清洗器，合肥金尼克機械制造公司；納晶，蘇州納通生物納米技術(shù)有限公司.

β-熊果苷(ABT)、VC乙基醚(EAA)、煙酰胺(NAA)、氮酮、聚二甲基硅氧烷(350-CS)、合成角鯊?fù)?IBIP)、辛酸/癸酸甘油三酯(GTCC)、碳十六十八醇(C16-18醇)、甘油(GC)、聚氧乙烯(100)硬脂酸酯(PEG-100)、失水山梨醇硬脂酸酯(Span-60)、聚氧乙烯單硬脂酸失水山梨醇酯(Tween-60)、羥乙基纖維素(HEC)，均為化妝品級；甲醇，色譜純；SPF級昆明種雄性小鼠，(20±2)g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.

2 實 驗

2.1 色譜條件

根據(jù)文獻[8-9]選擇色譜條件，色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流動相：甲醇-水(10∶90，v/v)，雙泵；流速：1 mL·min-1，進樣量：10 μL，柱溫30 ℃. ABT、EAA、NAA的檢測波長分別選擇為280, 245, 260 nm；保留時間分別為 1.28, 4.27, 2.24 min.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

精確稱取 ABT、EAA、NAA并配置成質(zhì)量濃度均為10 mg·mL-1的溶液作為母液.依次稀釋成20，60，150，300，400，500 μg·mL-1的ABT系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；5，20，40，150，300，400 μg·mL-1的EAA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；5，40，100，300，600，800 μg·mL-1的NAA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.在2.1色譜條件下進樣得到3種樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.3 待測液的制備

水溶液：精確稱取ABT、EAA、NAA并配置成質(zhì)量分數(shù)均為1.0%的水溶液ABT1、EAA1、NAA1.

乳液：按照表1的配方，將ABT、EAA以及NAA 3種美白劑分別加入其中，制得質(zhì)量分數(shù)均為1.0%的乳液ABT2、EAA2、NAA2.

表1 乳液配方

樣品促滲劑溶液的制備：在上述水溶液與乳液的制備過程中將氮酮(1.0%)加入其中，分別得到水加促滲劑溶液ABT3、EAA3、NAA3，以及乳液加促滲劑溶液ABT4、EAA4、NAA4.

2.4 體外經(jīng)皮實驗

取同一批(30只)健康的SPF級昆明種雄性小鼠(20±2) g，脫頸處死，取其腹部皮膚，統(tǒng)一保存.實驗前，隨機選取厚度相近的鼠皮去除脂肪層，刮去小鼠表皮的鼠毛，用生理鹽水洗凈[10]，小鼠皮膚固定在擴散池和接收池之間，角質(zhì)層面向擴散池，真皮層面向接收池，且與池中溶劑剛好接觸，以防止有氣泡產(chǎn)生.接收池的體積為15 mL，取待測液1 g置于擴散池中，在預(yù)先加入磁力攪拌子的接收池中加入蒸餾水，并將接收池放在智能透皮試驗儀的磁力攪拌器上，設(shè)置水浴溫度37 ℃，攪拌速率350 r·min-1，每隔2 h，通過取樣口取樣(同時補充等量的接收液)，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后進行色譜分析，計算累積透過率[11].試驗結(jié)束后，關(guān)閉儀器，取下鼠皮，用蒸餾水擦拭并沖洗表面，置于濾紙上常溫晾干后，用剪刀將鼠皮剪碎，并移到小燒杯中，蒸餾水超聲提取30 min后浸泡24 h，提取液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后進樣測定，計算不同滲透時間的皮膚滯留率[12].

2.5 美白活性成分的累積透過率隨時間的變化曲線

在體外經(jīng)皮實驗中，在2，4，6，8，10，12 h分別取3種美白劑的接收液進樣，得到ABT、EAA、NAA在不同時間的累積透過量并繪制出累積透過率隨時間變化的曲線.

2.6 供給液劑型的改變對美白劑滲透性的影響

取3種美白劑的水溶液和乳液各1 g，通過2.4中的體外經(jīng)皮實驗，探討它們的滲透性.

2.7 加入促滲劑后對美白劑滲透性的影響

取加入氮酮的3種美白劑水溶液和乳液各1 g，通過2.4中的體外經(jīng)皮實驗，探討促滲劑對各美白劑的滲透性影響.

2.8 鼠皮條件的改變對美白劑滲透性的影響

用納晶在鼠皮的表皮層進行處理(納晶片在鼠皮上來回作用3次)，將處理后的鼠皮按照2.6中的實驗方法，研究3種美白劑的水溶液、乳液在納晶處理過的鼠皮上的滲透性.此時對應(yīng)的美白劑水溶液記為ABT5、EAA5、NAA5，美白劑乳液為ABT6、EAA6、NAA6.

2.9 數(shù)據(jù)處理

按如下公式計算累積透過率與滯留率[13-14]

其中：Qn為累積透過量(mg)，qj為滯留量(mg)；cn為第n次取樣時接受液的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；cj為滯留量的濃度(mg·mL-1)；V0為接收池體積(mL)，Vi為取樣體積(mL)，V為鼠皮提取液的體積(mL)；Tn為累積透過率(%)，T為滯留率(%)；M為作用在鼠皮上美白劑的總質(zhì)量(mg).

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將3種美白劑的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進樣，以標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得到3種物質(zhì)的線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果列于表2.

表2 β-熊果苷、VC乙基醚和煙酰胺的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

3.2 美白劑的滲透性隨時間的變化

圖2為3種美白劑在水溶液中的累積透過率隨時間的變化曲線.

圖1 3種美白劑的累積透過率曲線

由圖1可以看出，隨滲透時間的延長，3種美白劑的累積透過率均逐漸增大，煙酰胺的累積透過率明顯大于其他兩種美白劑.滲透8 h時，ABT、EAA、NAA的累積透過率分別為50.2%，43.4%，61.0%；滲透12 h時，分別達到59.5%，54.1%，68.9%.考慮到護膚品在皮膚上的停留時間，以下實驗的滲透時間均選擇8 h.

3.3 美白劑在不同劑型中的滲透性

3種美白劑在不同劑型中的累積透過率、滯留率隨時間變化情況見表3～4.

表3 3種美白活性劑水溶液的累積透過率與滯留率

表4 3種美白活性劑乳液的累積透過率與滯留率

由表3、4可見，無論是在水溶液還是乳液中，隨著滲透時間的延長，3種美白劑累積透過率和滯留率均呈現(xiàn)遞增趨勢；同樣的滲透時間，煙酰胺的累積透過率最大，VC乙基醚最低；熊果苷的滯留率最大，煙酰胺的最低.對于單個的美白劑來說，水溶液中的累積透過率均大于乳液中的累積透過率，而滯留率均小于乳液中的滯留率；滲透8 h后，水溶液中的累積透過率與滯留率分別為50.2%, 6.7%(ABT)；43.4%, 1.9%(EAA)；61.0%, 3.0%(NAA).乳液中的累積透過率與滯留率分別為14.0%, 9.6%(ABT)；25.7%, 4.3%(EAA)；45.0%, 4.5%(NAA).

人體皮膚角質(zhì)層中的含水量大約在20%，其中25%～ 35%的水是結(jié)合水，其余的為自由水，角質(zhì)層中存在一個水樣的小孔通道，水在促滲系統(tǒng)的研究中也被看作是一種促滲劑，因而增加組織的水化作用能夠提高水溶性活性組分的滲透性[15]；對于乳液系來說，油脂和增稠劑的加入使乳液系的稠度和黏度均明顯增加，使得其滲透性弱于水溶液.即在水溶液中有利于這3種美白物質(zhì)的滲透，乳液則更有利于這3種美白物質(zhì)在皮膚中累積.

3.4 氮酮對3種美白劑滲透性的影響

在經(jīng)皮給藥實驗中為了使藥物更好地進入皮膚，往往都會選擇添加一定的促滲劑來達到預(yù)期的目的.氮酮是一種新型高效、無毒、無刺激性的透皮吸收促進劑，對親水性和疏水性成分均有較好的促滲作用[16].氮酮作為一種能夠促進活性組分向皮膚中滲透的物質(zhì)，是由于其能夠溶解角質(zhì)層中的脂質(zhì)，從而改變角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)，促進活性組分的吸收[15].

表5、6為加入氮酮后3種美白劑的累積透過率與滯留率.

表5 3種加促滲劑氮酮的美白活性劑水溶液的累積透過率與滯留率

表6 3種加促滲劑氮酮的美白活性劑乳液的累積透過率與滯留率

由表5、6與表3、4相比較可看出，水溶液與乳液在加入氮酮后累積滲透率均隨著滲透時間的延長而增加，但滯留量相較于未加氮酮之前卻有所減少.

通過觀察3種美白劑的累積滲透率發(fā)現(xiàn)，隨著滲透時間的延長，氮酮對3種美白劑的促滲作用有所不同.與表3、4中不加氮酮的水溶液、乳液相比，加入氮酮后，ABT水溶液滲透2 h時的增加幅度最大(54.8%)，乳液則在8 h時的增加幅度最大(51.3%)；EAA水溶液在4 h的增加幅度最大(54.1%)，乳液在8 h的增加幅度最大(17.7%)；NAA水溶液在4 h增加幅度最大(33.5%)；乳液在2 h的增加幅度最大(25.0%).說明氮酮更有利于ABT的滲透，更有利于水溶液中活性組分的滲透，即氮酮對水溶性藥物促滲作用較強[17].

3.5 鼠皮經(jīng)納晶處理后的滲透性分析

納晶，又稱作納米晶片，作為一種新型的促滲美膚工具逐漸被人們所熟知.它與皮膚的作用面由許多直徑小于100 nm的納米針組成.在很短的時間中，納晶能夠跟微針一樣，在皮膚表面打開非常多的細小的通道[18]，從而達到促進活性組分吸收的目的.與傳統(tǒng)的一些傳輸方式相比，它具有操作簡單方便、無痛等優(yōu)點[19].

表7、8為鼠皮經(jīng)納晶處理后3種美白劑水溶液、乳液的累積透過率與滯留率隨時間變化情況.

表7 3種美白活性劑水溶液在經(jīng)納晶處理后的鼠皮上的累積透過率與滯留率

表8 3種美白活性劑乳液在經(jīng)納晶處理后的鼠皮上的累積透過率與滯留率

由表7、8可看出，鼠皮經(jīng)納晶處理后，隨著滲透時間的延長，3種美白劑的滯留率略有減少；累積透過率在逐漸增加.但不同劑型、不同滲透時間，其增加的幅度有所不同.與表3、表4中未處理的水溶液、乳液相比，ABT滲透2 h后累積透過率的增加幅度最大，在水溶液中達32.9%，在乳液中為14.9%；EAA水溶液在2 h的增加幅度最大(23.5%)，乳液在8 h的增加幅度最大(20.3%)；NAA水溶液在4 h的增加幅度最大(25.7%)，乳液在2 h時的增加幅度最大(11.8%).可見納晶處理鼠皮后更有利于水溶液中ABT的滲透.

在經(jīng)納晶處理后短時間內(nèi)皮膚的通道得以打開使得累積透過率變化較明顯.但隨著時間的延長以及皮膚自身的作用，細小的通道又發(fā)生閉合[20].經(jīng)納晶處理后，3種美白劑的累積透過率在水溶液中的增加相較于乳液要明顯，而滯留率的變化很小且不明顯，說明納晶處理更有利于水溶液中活性組分的滲透，而對微米級的乳化顆粒促滲效果并不顯著.

4 結(jié)束語

筆者通過體外經(jīng)皮實驗對3種水溶性美白劑 β-熊果苷、VC乙基醚和煙酰胺的滲透性進行了研究.由實驗結(jié)果看出：水溶液中，相同滲透時間煙酰胺的累積透過率最大；3種美白劑的累積透過率和滯留率均隨著滲透時間的延長而增加；同一物質(zhì)在水溶液中的累積透過率高于乳液中的，滯留率小于乳液中的.由此可見，水溶液有利于活性物質(zhì)透過皮膚，而乳液劑型更有利于其在皮膚中累積.加入氮酮、預(yù)先用納晶處理鼠皮等方式均可增大各組分的滲透率，但同時滯留量也均有所減少.氮酮的促滲性能總體上要好于納晶處理.氮酮對親水性和疏水性的化合物都能增強其透皮作用，在日常生活及生產(chǎn)中用途廣泛，但由于其對酸堿不穩(wěn)定，可能會使配方中油水分離，因此對于產(chǎn)品的穩(wěn)定性可能產(chǎn)生影響.納晶屬于一種新型的促滲手段，雖然使用較為繁瑣，促滲效果也弱于氮酮，但從安全護膚的角度來說不失為一個更好的選擇.