孫其龍，潘珊珊，黃 悅，王家銀，陸 矯

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運動預適應通過間歇性缺血缺氧誘導細胞自噬參與早期心肌保護的研究

孫其龍，潘珊珊，黃 悅，王家銀，陸 矯

上海體育學院 運動科學學院, 上海 200438

目的：通過分析運動性心肌缺血缺氧與細胞自噬的關系，檢測自噬相關蛋白Beclin1/Bcl-2在早期運動預適應（EEP）及保護期的變化，探討細胞自噬在EEP心肌保護效應中的作用。方法：SD大鼠隨機分為對照組（C組）、早期運動預適應組（EEP組）、力竭運動組（EE組）和早期運動預適應+力竭運動組（EEP+EE組）。1）用化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）檢測血漿cTnI含量，結(jié)合HE和HBFP相鄰切片染色，綜合評價心肌缺血缺氧的程度，驗證EEP心肌保護效應。2）用免疫印跡和免疫熒光雙標法檢測并觀察Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度。3）通過相關性分析評估運動性缺血缺氧與細胞自噬的關系。結(jié)果：1）與C組相比，EEP組血漿cTnI水平和MOD值均具有升高的趨勢（＞0.05），且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組cTnI水平和MOD值顯著降低（＜0.05）；與C組相比，其余各組心肌組織均顯示不同程度的缺血缺氧改變，HE染色嗜酸性增強部位與HBFP染色艷紅色陽性區(qū)域趨近一致。2）與C組相比，其余各組Beclin1均顯著升高（＜0.05），Beclin1/Bcl-2解離程度增加（＜0.05），而Bcl-2并無明顯變化；與EE組相比，EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著升高（＜0.05）。3）各組IHA和IOD值均與Beclin1/Bcl-2共定位程度呈顯著負相關（＜0.05）。結(jié)論：EP通過間歇性缺血缺氧可以誘導心肌細胞自噬，細胞自噬參與了EP對運動性心肌損傷的早期保護效應。

運動預適應；缺血缺氧；Beclin1；Bcl-2；細胞自噬；早期心肌保護

反復短時間的大強度間歇有氧運動導致心肌間歇性相對間或絕對缺血缺氧，提高心肌耐受缺血缺氧的能力，減輕隨后長時間缺血缺氧所致的心肌損傷，這種通過運動誘導機體產(chǎn)生內(nèi)源性心肌保護效應的方式稱為運動預適應（exercise preconditioning，EP）[3,18,20,22]。研究發(fā)現(xiàn)，EP的保護效應與缺血預適應（ischemic preconditioning，IP）類似，具有抗缺血/再灌注（ischemic/reperfusion，I/R）損傷的心肌保護效應，如減輕I/R損傷后心肌梗塞面積，降低惡性心率失常的發(fā)生率，預防心肌頓抑等[8,22]。本研究團隊曾發(fā)現(xiàn)，EP具有抵抗異丙腎上腺素導致的急性心肌損傷[25]，減輕力竭運動導致的運動性心肌損傷[11,24]。EP可以分為誘導期和保護期，通過反復短時間的大強度間歇有氧運動誘導早期和晚期兩個保護時相。早期EP（early exercise preconditioning，EEP）保護期在EP結(jié)束后即可產(chǎn)生，持續(xù)1～3 h，晚期EP（late exercise preconditioning，LEP）保護期在EP結(jié)束后12 h出現(xiàn)，24~48 h達到高峰，持續(xù)24~72 h[3,14]。

自噬是真核細胞內(nèi)特有的生命現(xiàn)象，可選擇性的將細胞內(nèi)衰老、損傷的細胞器或蛋白質(zhì)，在溶酶體內(nèi)降解再利用的生理過程[2,9]。正常生理條件下，自噬通常維持在相對較低的水平，當細胞受到能量缺乏、氧化應激、缺血缺氧等因素刺激時，自噬被激活，從而參與并維持細胞的存活以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9,15]。自噬的發(fā)生受多種信號通路的調(diào)控，有著復雜的分子機制，其中，Beclin1作為多種信號通路的匯集點，通過與Bcl-2相互作用發(fā)揮至關重要的調(diào)控作用[12]。在應激因素刺激下，Beclin1/Bcl-2所保持的復合體形式解離，游離的Beclin1繼而發(fā)揮誘導自噬的功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬的發(fā)生與Beclin1表達上調(diào)和Bcl-2表達下調(diào)相關聯(lián)，而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能夠反映自噬與凋亡的程度[19]。Peng等[23]為探討細胞自噬在缺血性心臟中的作用，發(fā)現(xiàn)IP能夠增強Beclin1/Bcl-2相互作用，誘導心肌細胞自噬減輕I/R損傷，參與了缺血性心臟的早期保護作用。馬曉雯等[1]在探討長期耐力訓練對自噬相關因子Beclin1的影響時發(fā)現(xiàn)，大強度運動訓練可以增強大鼠心肌細胞自噬的活性，同時伴有Beclin1水平的明顯升高。萬棟峰等[3]研究了心肌線粒體自噬在EP晚期保護效應中的作用，發(fā)現(xiàn)抑制細胞自噬后EP對運動性心肌損傷的晚期保護作用減弱，提示細胞自噬部分參與了EP的晚期心肌保護效應?；谏鲜鲅芯勘尘埃狙芯考僭OEP通過間歇性缺血缺氧能夠誘導心肌細胞自噬，而細胞自噬可能參與了EP對運動性心肌損傷的早期保護效應。本研究在EP動物模型的基礎上，采用相鄰切片HE和HBFP染色評價心肌缺血缺氧程度；通過相關性分析評估心肌缺血缺氧與細胞自噬的關系；采用血漿心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）檢測與HBFP染色驗證EP早期心肌保護效應；結(jié)合免疫印跡和免疫熒光雙標實驗，檢測并觀察自噬相關蛋白Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度，探討細胞自噬在EP早期保護效應中的作用，為EP心肌保護效應及機制的研究提供新的實驗依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 動物分組和運動實驗方案

圖1 運動實驗方案示意圖

Figure 1．Exercise Experimental Protocol

1.2 動物取材

采用10%水合氯醛（40 mg/100 g體重）對大鼠進行腹腔麻醉，將麻醉后的大鼠呈仰臥位固定于解剖臺上，打開腹腔，下腔靜脈取血5 mL，用于cTnI含量檢測。每組隨機取10只大鼠進行灌注固定，打開胸腔，暴露心臟，于心尖處插入灌注針頭，先注入1%肝素2 mL，再快速灌注0.85%生理鹽水約250 mL，并迅速剪斷下腔靜脈。待流出液基本無血色后，換滴4%多聚甲醛約250 mL，整個灌注過程大約持續(xù)30 min。灌注結(jié)束后取出心臟，入4%多聚甲醛后固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，制作相鄰切片，用于HE染色、HBFP染色和免疫熒光雙標實驗。每組其余10只大鼠麻醉取血后，打開胸腔，取出心臟，-80℃保存，用于免疫印跡實驗。

1.3 血漿cTnI 含量檢測

用化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoas-say, CLIA）檢測大鼠血漿cTnI含量。CLIA是一種雙抗體一步夾心免疫酶檢測方法，采用堿性磷酸酶標記的單克隆cTnI IgG抗體試劑與樣本短暫孵育后，加入順磁性微粒作為固相載體與樣本中cTnI結(jié)合，再加入化學發(fā)光底物（Lumi-Phos*530），用光度計測量發(fā)光量，發(fā)光量與cTnI的濃度成正比，采用Beckman Coulter公司的Access 2免疫分析系統(tǒng)進行測定，線性范圍為0.02～100 ng/mL。

1.4 心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色

用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察心肌細胞的形態(tài)結(jié)構，其嗜酸性增強用于顯示缺血缺氧的心肌組織。用蘇木素-堿性復紅-苦味酸（hematoxylin basic fuchsin picric staining，HBFP）染色特異性顯示心肌組織的缺血缺氧變化，正常心肌組織被染成棕黃色，而缺血缺氧的心肌組織則被染成艷紅色。用HE和HBFP染色的相鄰切片綜合評價心肌組織缺血缺氧的程度。使用Leica（RM2235）切片機進行連續(xù)切片，用心肌組織相鄰切片分別進行常規(guī)HE染色和HBFP染色。HBFP染色切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染液浸染5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，用0.1%堿性復紅液浸染3 min，去離子水沖洗后丙酮漂洗30 s，0.1%苦味酸純丙酮浸染40 s，脫水透明后，中性樹膠封片。

1.5 心肌組織HBFP染色圖像采集與處理

每組隨機選取5張HBFP染色切片，每張切片隨機選取5個視野，每組共測25個視野，使用Olympus（BX60）顯微鏡進行形態(tài)學觀察，DP70數(shù)碼攝影裝置采集圖像，使用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行圖像處理。在同一放大倍數(shù)下（×400），測定缺血缺氧面積（ischemia-hypoxia area，IHA）與積分光密度（integral optical density，IOD），并計算平均光密度（mean optical density，MOD），以表示單位面積內(nèi)缺血缺氧損傷的程度（MOD=IOD/ IHA）。

1.6 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫印跡實驗

用免疫印跡實驗檢測心肌組織Beclin1/Bcl-2的表達變化。大鼠心肌組織提取總蛋白，BCA法檢測并調(diào)整蛋白濃度。加入上樣緩沖液，100℃恒溫加熱10 min使蛋白變性。SDS凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別孵育一抗（小鼠抗大鼠Beclin1，美國Santa Cruz公司，sc-11427，1:1 000；兔抗大鼠Bcl-2，美國Santa Cruz公司，sc-492，1:1 000），4℃過夜。加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。滴加發(fā)光液后，采用Fusion FX全自動化學發(fā)光成像圖像獲取系統(tǒng)進行曝光顯影，采用Image J分析軟件測定Beclin1、Bcl-2及內(nèi)參GAPDH的條帶灰度值。

1.7 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標實驗

用免疫熒光雙標實驗觀察Beclin1/Bcl-2熒光強度及共定位程度。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波熱修復20 min。山羊血清封閉20 min后，加入Beclin1/Bcl-2混合一抗（小鼠抗大鼠Beclin1，美國Santa Cruz公司，sc-11427，1:200；兔抗大鼠Bcl-2，美國Santa Cruz公司，sc-492，1:200），4℃孵育過夜。滴加Alexa Fluor 647（紅）、Alexa Fluor 488（綠）標記的混合二抗(Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG，美國abcam公司，ab150111，1:400；Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG，美國abcam公司，ab150081，1:400），37℃溫箱孵育60 min。DAPI染核，5 min后流水沖洗終止反應，PVP防熒光淬滅劑封片。采用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。每組隨機選取5張切片，每張切片隨機選取5個視野，每組共測25個視野，在同一放大倍數(shù)下（×400），用Zen 2012（black version）計算機圖像分析軟件分析熒光強度和共定位程度。熒光強度反映Beclin1/Bcl-2蛋白的表達變化情況，共定位程度反映Beclin1/Bcl-2復合體的解離情況。

1.8 心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度的相關性

采用HBFP染色中IHA和IOD值，分別與免疫熒光雙標實驗中Beclin1/Bcl-2共定位程度進行相關性分析，評估心肌組織缺血缺氧與細胞自噬的關系。每組隨機選取5張HBFP染色切片，每張切片隨機選取5個視野，每組共測25個視野，使用Olympus（BX60）顯微鏡進行形態(tài)學觀察，DP70數(shù)碼攝影裝置采集圖像，使用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行圖像處理，測定IHA和IOD值。每組選取5張免疫熒光雙標相鄰切片，每張切片選取相對應的5個視野，每組共測25個視野，使用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，采用Zen 2012（black version）計算機圖像分析軟件測定Beclin1/Bcl-2共定位程度。每組IHA和IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位測定值相對應，進行相關性分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（M±SD）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗進行組間比較，相關性分析用CORRELATE中Bivariate檢驗，以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 血漿cTnI含量檢測結(jié)果

大鼠血漿cTnI含量檢測結(jié)果顯示（表1），與C組相比，EEP組大鼠血漿cTnI水平有升高的趨勢（＞0.05），且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組血漿cTnI水平顯著降低（＜0.05）。

表 1 大鼠血漿cTnI水平變化

注：*表示與C組相比＜0.05；#表示與EE組相比＜0.05，下同。

2.2 心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果

大鼠心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果顯示（圖2），HE染色中C組心肌細胞輪廓界限清晰，細胞核呈卵圓形，被染為淡藍色，細胞質(zhì)著色均勻，被染為淡紅色，未見嗜酸性增強區(qū)域（圖2-A）；EEP組心肌細胞形態(tài)結(jié)構與C組相似，偶有心肌細胞出現(xiàn)嗜酸性增強的現(xiàn)象（圖2-B）；EE組大量心肌細胞出現(xiàn)嗜酸性增強的現(xiàn)象（圖2-C）；EEP+EE組少部分心肌細胞出現(xiàn)了嗜酸性變化，較EE組明顯減少（圖2-D）。HBFP染色中正常心肌組織被染為棕黃色，缺血缺氧心肌組織被染為艷紅色；C組心肌細胞輪廓清晰，細胞核被染為淡紫藍色，未見艷紅色陽性區(qū)域（圖2-E）；EEP組偶有心肌細胞出現(xiàn)斑點狀的艷紅色陽性區(qū)域（圖2-F）；EE組中大量心肌細胞出現(xiàn)艷紅色陽性區(qū)域（圖2-G）；EEP+EE組部分心肌細胞出現(xiàn)了團塊狀艷紅色陽性改變，較EE組明顯降低（圖2-H）。在HE染色和HBFP染色的相鄰切片上，從缺血缺氧損傷區(qū)域的位置比照中發(fā)現(xiàn)，各組HE染色嗜酸性增強部位與HBFP染色艷紅色陽性區(qū)域趨近一致（圖2）。

圖2 大鼠心肌組織相鄰切片HE和HBFP染色結(jié)果圖（×400）

Figure 2. Results of HE and HBFP Staining of Adjacent Slices in Rats Myocardium（×400）

2.3 心肌組織HBFP染色圖像分析結(jié)果

心肌組織HBFP染色圖像分析結(jié)果顯示（表2），心肌組織IHA和IOD值變化趨勢相似，用MOD值表示各組大鼠心肌組織中單位面積內(nèi)缺血缺氧的程度。與C組相比，EEP組MOD值具有升高的趨勢（＞0.05），且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組MOD值明顯降低，差異具有顯著性（＜0.05）。

2.4 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫印跡檢測結(jié)果

大鼠心肌組織Beclin1免疫印跡檢測結(jié)果顯示（圖3），與C組相比，其余各組Beclin1蛋白水平均明顯升高，差異具有顯著性（＜0.05）；Bcl-2免疫印跡檢測結(jié)果顯示（圖4），各組Bcl-2蛋白水平無顯著性變化；Beclin1/Bcl-2比值結(jié)果顯示（圖5），與C組相比，EEP組Beclin1/Bcl-2比值具有升高的趨勢（＞0.05），且EE組、EEP+EE組升高具有顯著性（＜0.05）。

表2 大鼠心肌組織HBFP染色結(jié)果圖像分析

注：*與C組相比＜0.05；#與EE組相比＜0.05。

圖3 大鼠心肌組織Beclin1水平變化圖

Figure3. Change of Beclin1 Level in Rats Myocardium

圖4 大鼠心肌組織Bcl-2水平變化圖

Figure4. Change of Bcl-2 Level in Rats Myocardium

圖5 大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2水平變化圖

Figure5. Change of Beclin1/Bcl-2 Level in Rats Myocardium

2.5 心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標結(jié)果

大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2免疫熒光雙標檢測結(jié)果顯示（圖6），Beclin1被標記為紅色熒光，Bcl-2被標記為綠色熒光，二者的共定位重疊區(qū)域為黃色，均散在分布于胞質(zhì)中，細胞核被DAPI標記為藍色。與C組（圖6-A）相比，EEP組（圖6-B）、EE組（圖6-C）、EEP+EE組（圖6-D）Beclin1紅色熒光強度均有不同程度的增加，而黃色共定位區(qū)域則均有不同程度的降低，提示，EEP組、EE組和EEP+EE組Beclin1蛋白表達升高，Beclin1/Bcl-2復合體解離程度加強；與EE組（圖6-C）相比，EEP+EE組（圖6-D）紅色熒光強度減弱，而黃色共定位區(qū)域增多，提示，EEP+EE組Beclin1蛋白表達降低，Beclin1/Bcl-2復合體解離程度降低。

圖6 大鼠心肌組織Beclin1和Bcl-2免疫熒光雙標實驗結(jié)果圖（×400）

Figure 6. Double Immunotluorescence Results of Beclin1 and Bcl-2 in Rats Myocardium（×400）

Beclin1熒光強度結(jié)果顯示（圖7），與C組相比，其余各組Beclin1熒光強度均顯著升高（＜0.05）。Bcl-2熒光強度結(jié)果顯示（圖8），各組Bcl-2熒光強度無顯著性差異。Beclin1/Bcl-2共定位程度結(jié)果顯示（圖9），與C組相比，其余各組Beclin1/Bcl-2共定位程度均明顯降低，差異具有顯著性（＜0.05）；與EE組相比，EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度則顯著升高（＜0.05）。

圖7 大鼠心肌組織Beclin1熒光強度柱狀圖

Figure 7. Intensity of Beclin1 in Rats Myocardium

圖8 大鼠心肌組織Bcl-2熒光強度柱狀圖

Figure 8. Intensity of Bcl-2 in Rats Myocardium

圖9 大鼠心肌組織Beclin1/Bcl-2共定位程度柱狀圖

Figure 9. Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rats Myocardium

2.6 心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度相關性

大鼠心肌組織HBFP染色IHA和IOD值與免疫熒光雙標Beclin1/Bcl-2共定位程度的相關分析結(jié)果顯示（圖10），EEP組（圖10-a）大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關（=-0.783，＜0.05），IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關（=-0.772，＜0.05）；EE組（圖10-b）大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關（=-0.905，＜0.05），IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關（=-0.912，＜0.05）；EEP+EE組（圖10-c）大鼠心肌組織IHA值與Beclin1/Bcl-2共定位程度高度負相關（=-0.861，＜0.05），IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度之間高度負相關（=-0.853，＜0.05）。以上結(jié)果顯示，EEP組（圖10-a）、EE組（圖10-b）、EEP+EE組（圖10-c）IHA和IOD值與Beclin1/Bcl-2共定位程度之間，均存在高度負相關關系，提示，隨著缺血缺氧損傷程度的升高，Beclin1/Bcl-2復合體解離，更多游離的Beclin1參與了自噬發(fā)生的誘導作用，心肌細胞自噬水平也因此升高。

3 討論

3.1 運動預適應通過間歇性缺血缺氧誘導心肌細胞自噬

運動作為一種強烈的刺激因素，極大地提高了心肌耗氧量，導致心肌相對間或絕對缺血缺氧[11]。HE染色便于對心肌組織結(jié)構全面觀察，以往也常用心肌細胞的嗜酸性增強間接顯示心肌組織的缺血缺氧，但其不具備特異性。HBFP染色是顯示心肌組織早期缺血缺氧的形態(tài)學方法，顯示心肌組織的缺血缺氧具有特異性，因此，長期以來本研究團隊采用HBFP染色方法，用于評價心肌組織的缺血缺氧改變。本次實驗采用HE染色和HBFP染色的相鄰切片，綜合評價心肌組織缺血缺氧的改變程度。結(jié)果顯示，與C組相比，其余各組HE染色中，心肌組織均出現(xiàn)了不同程度嗜酸性增強的現(xiàn)象；HBFP染色中心肌組織同樣出現(xiàn)了不同程度的艷紅色陽性區(qū)域，EEP組MOD值具有升高的趨勢，且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性；在相鄰切片的基礎上，通過心肌組織缺血缺氧區(qū)域的位置比照，本研究發(fā)現(xiàn)，各組HE染色中嗜酸性增強部位與HBFP染色中艷紅色陽性區(qū)域趨近一致。這提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均導致大鼠心肌組織發(fā)生不同程度的缺血缺氧改變。

Beclin1是介導哺乳動物自噬的基因，對于自噬的發(fā)生有著重要的促進作用。Bcl-2是一種抗凋亡基因，可通過與Beclin1相互作用影響自噬過程[12]。在正常生理條件下，Bcl-2與Beclin1以蛋白復合體形式存在，由此抑制了Beclin1誘導自噬的功能[5]。但當細胞受到應激因素刺激時，Beclin1/Bcl-2復合體解離，游離的Beclin1繼而與PI3KC3結(jié)合形成新的復合體，從而誘導細胞自噬的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬的發(fā)生與Beclin1表達上調(diào)和Bcl-2表達下調(diào)相關聯(lián)，而Beclin1/Bcl-2比值也在一定程度上能夠反映凋亡與自噬的程度[19]。Huang等[13]在探討細胞自噬與IP心臟保護效應的關系時，發(fā)現(xiàn)IP能夠激活心肌細胞自噬，并能有效減小I/R后心肌梗死面積。Yuan等[26]在EP心肌保護效應的研究中發(fā)現(xiàn)，EP可以減輕一次大強度力竭運動所致的心肌缺血缺氧損傷，同時伴有自噬相關蛋白的明顯變化。為進一步探討心肌缺血缺氧與細胞自噬的關系，本研究特別采用免疫熒光雙標實驗檢測Beclin1/Bcl-2共定位程度，并分別與HBFP染色中的IHA和IOD值進行相關性分析。結(jié)果顯示，EEP組、EE組和EEP+EE組中，IHA和IOD值均與Beclin1/Bcl-2共定位程度呈顯著負相關關系，提示，隨著心肌缺血缺氧程度的升高，Beclin1/Bcl-2復合體解離，更多游離的Beclin1參與了自噬發(fā)生的誘導作用，心肌細胞自噬水平也因此升高。此結(jié)果進一步提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均可通過缺血缺氧誘導心肌細胞自噬。

圖10 大鼠心肌組織缺血缺氧與Beclin1/Bcl-2共定位程度相關分析圖

Figure 10. The Correlation between the Ischemia-hypoxia and the Colocalization of Beclin1/Bcl-2 in Rat Myocardium

3.2 細胞自噬參與運動預適應早期心肌保護效應

EP早期保護效應已被較多研究所證實。Parra等[22]在EP結(jié)束10 min后對狗進行的I/R中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死面積相比對照組減少了76%，提示，EP誘導的早期保護效應可以減輕I/R損傷。Shen等[24]探討EP心肌保護作用時，在EP結(jié)束后30 min對大鼠進行了一次大強度力竭運動，發(fā)現(xiàn)EP可以明顯減輕力竭運動所致的心肌損傷，對運動性心肌損傷產(chǎn)生了早期保護作用。cTnI是心肌細胞特有的結(jié)構蛋白，對心肌損傷具有較高的特異性、敏感性以及較長的窗口期，現(xiàn)已成為診斷心肌損傷的“金標準”。Eijsvogels等[7]在運動強度與cTnI釋放量關系的研究中發(fā)現(xiàn)，運動員血液中cTnI含量與運動強度之間存在顯著正相關關系。本研究在EP結(jié)束30 min后，對大鼠進行一次大強度力竭運動，采用血漿cTnI檢測與HBFP染色相結(jié)合的方法，從血液和形態(tài)學方面綜合評價心肌損傷與保護程度。結(jié)果顯示，與EE組相比，EEP+EE組血漿cTnI水平和MOD值均顯著降低，進一步證實EP可以提高心肌耐受缺血缺氧的能力，減輕心肌在一次大強度力竭運動中的缺血缺氧損傷，對運動性心肌損傷具有早期保護作用。

細胞自噬可能是EP參與心肌保護的機制之一。Gurusamy等[10]在自噬相關蛋白BAG-1與IP心臟保護效應的研究中發(fā)現(xiàn)，IP誘導了Beclin1表達升高的細胞自噬，參與了I/R所致心肌損傷的保護作用。Mcginnis等[21]在探討EP對心肌I/R損傷的保護作用時，對小鼠進行速度為18 m/min的跑臺運動，發(fā)現(xiàn)EP同樣減輕了心肌I/R損傷，同時增強了自噬相關蛋白的活性，但并未發(fā)現(xiàn)Beclin1發(fā)生顯著性變化。本研究對大鼠進行速度為30 m/min的大強度跑臺運動，采用免疫印跡與免疫熒光雙標實驗相結(jié)合的方法，綜合評價Beclin1/Bcl-2的表達變化和解離程度。結(jié)果顯示，與C組相比，其余各組Beclin1蛋白水平均顯著升高，Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著降低，同時，Beclin1/Bcl-2比值有升高趨勢，且EE組和EEP+EE組升高具有顯著性，提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均可促使Beclin1蛋白表達的升高，促進Beclin1/Bcl-2復合體解離，并有效上調(diào)心肌細胞自噬水平。本研究免疫熒光雙標實驗結(jié)果顯示，與EE組相比，EEP+EE組Beclin1/Bcl-2共定位程度顯著升高，提示，在EP早期心肌保護效應中，Beclin1表達升高的細胞自噬部分參與了EP對運動性心肌損傷的保護作用。

自噬在心血管應激中是把“雙刃劍”，適度自噬有助于細胞保護和生存，但自噬過度或自噬缺陷將導致細胞損傷或死亡。有研究表明，在一定條件下自噬可以轉(zhuǎn)化為自噬性細胞凋亡[17]。Liu等[16]探討了細胞自噬在不同強度運動中的作用，發(fā)現(xiàn)隨著運動強度的增加，細胞自噬和凋亡程度均明顯升高，超負荷運動會使大鼠心肌細胞自噬體數(shù)量增加，凋亡細胞增多，同時伴有Beclin1表達升高和Bcl-2/Bax比值的下降。Meyer等人[6]認為，在應激刺激的初始階段，自噬可通過維持細胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)參與細胞的保護作用，但隨著刺激強度的增加，自噬角色可能會在細胞保護和損傷之間發(fā)生切換。本研究結(jié)果提示，不論是EEP及EEP保護期，還是一次大強度力竭運動，均可通過缺血缺氧誘導心肌細胞自噬，但EEP本身并未導致明顯的心肌損傷，且EEP誘導的細胞自噬參與了EP對力竭所致的心肌損傷的早期保護作用。一次大強度力竭運動導致明顯的心肌損傷，其誘導的心肌細胞自噬是進一步減輕心肌損傷，還是使心肌損傷程度進一步加重，尚待深入探討。

4 結(jié)論

EP通過間歇性心肌缺血缺氧可以上調(diào)自噬相關蛋白Beclin1的表達，促進Beclin1/Bcl-2復合體解離，誘導心肌細胞自噬。細胞自噬參與了EP對力竭運動所致的心肌缺血缺氧損傷的早期保護作用。

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Exercise Preconditioning Induces Cellular Autophagy by Intermittent Ischemia-Hypoxia to Participate in Early Myocardial Protection

SUN Qi-long，PAN Shan-shan，HUANG Yue，WANG Jia-yin，LU Jiao

Shanghai University of Sport, Shanghai 200438, China.

Objective: By analyzing the relationships between myocardial ischemia-hypoxia and cellular autophagy in exercise, and by detecting changes of autophagy-associated proteins Beclin1/Bcl-2 in early exercise preconditioning (EEP) and in early protective phase, the effects of cellular autophagy on EEP-cardioprotection were discussed. Methods: SD rats were randomly divided into the groups of control (C group), early exercise preconditioning (EEP group), exhaustive exercise (EE group), and early exercise preconditioning+exhaustive exercise (EEP+EE group). 1）The plasma cTnI contents were detected by chemiluminescence immunoassay (CLIA) method, which were combined with the adjacent slices between HE-staining and HBFP-staining, to comprehensively assess the extents of myocardial ischemia-hypoxia, and to verify the EEP-cardioprotection. 2) The expressional changes and the dissociated degrees in Beclin1/Bcl-2 were detected by immune-blotting, and were observed by double-labeling immunofluorescence, respectively. 3) The relationships between exercise-induced hypoxia-ischemia and cellular autophagy were assessed by the correlational analysis. Results: 1) Compared with the C group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to both have increasing tendencies (>0.05), and these in the EE group and in the EEP+EE group to were both significant increase (＜0.05). Compared with the EE group, the plasma cTnI levels and the MOD values in the EEP group to were both significant decrease (＜0.05). Compared with the C group, all other groups to represent ischemia-hypoxia changes in different degree, which were as the acidophily-enhanced positions in HE-staining approaching to the positive areas of crimson in HBFP-staining. 2) Compared with the C group, all other groups to have significantly increased Beclin1 levels (＜0.05), and to have increased extents of Beclin1/Bcl-2 dissociations (＜0.05), but which were without any changes in Bcl-2 levels. Compared with the EE group, the extents of Beclin1/Bcl-2 co-localization were significant increase (＜0.05). All groups represented with significantly negative correlations between the Beclin1/Bcl-2 co-localization and the ischemia-hypoxia areas, and the IOD values respectively. Conclusion: EP can induces autophagy in cardiomyocytes by intermittent ischemia-hypoxia, in which the cellular autophagy participates in the early myocardial protection against the exercise-induced myocardial injury.

1000-677X(2018)07-0025-08

10.16469/j.css.2018070015

G804.7

A

2018-02-12；

2018-07-08

國家自然科學基金資助項目(31471136)。

孫其龍,男,在讀碩士研究生,主要研究方向為運動與心血管健康,E-mail:578926656@qq.com; 潘珊珊,女,教授,博士,博士研究生導師,主要研究方向為運動與心血管健康, E-mail:panshanshan@sus.edu.cn。