王艷萍，陳雪琴

（陜西省商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西商洛 726000）

腰痛片為2015版中國(guó)藥典收載的成方制劑[1]，主要由杜仲葉、補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、當(dāng)歸、白術(shù)、牛膝、肉桂、乳香、狗脊、赤芍、澤瀉、土鱉蟲等十二味中藥組成，具有補(bǔ)腎活血，強(qiáng)筋止痛之功效[2]。用于腎陽(yáng)不足、淤血阻絡(luò)所致的腰痛及腰肌勞損等癥[1,3]。補(bǔ)骨脂作為其強(qiáng)筋骨的主要組方，對(duì)其有效成分進(jìn)行快速測(cè)定就顯得很有必要。陳瑩等[4]綜述補(bǔ)骨脂化學(xué)成分主要有香豆素類、單萜類、黃酮類以及甾醇類，而香豆素類組分主要是補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和甲氧補(bǔ)骨脂素。2010版中國(guó)藥典一部腰痛片中補(bǔ)骨脂含量測(cè)定方法為高效液相色譜法[5]，流動(dòng)相采用的是甲醇-磷酸氫二鈉（0.1 mol·L-1）溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至7），二者比例為35：65，測(cè)定處方中補(bǔ)骨脂有效成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。然而，采用該流動(dòng)相測(cè)定樣品時(shí)，出峰時(shí)間大多在50 min以后，時(shí)間太長(zhǎng)。同時(shí)，由于該流動(dòng)相中引入了鹽溶液，整個(gè)流路系統(tǒng)容易堵塞，從而影響工作進(jìn)度[6]?；诖耍疚膶?duì)中藥復(fù)方腰痛片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一種快速有效的測(cè)定腰痛片中有效成分的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀，購(gòu)自日本島津公司；BS224S電子分析天平（d=0.01 mg）和BT125D電子分析天平（d=0.01 mg），購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1801/1801PC紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)自上海譜析儀器有限公司；SCS-1B純水機(jī)，購(gòu)自北京先鋒威驅(qū)技術(shù)開發(fā)公司；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗儀，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑

色譜級(jí)乙腈、甲醇（美國(guó)Sigma-Aidrich公司），磷酸氫二鈉（天津市百世化工有限公司）、磷酸（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（天津市紅巖化學(xué)試劑廠）等均為優(yōu)級(jí)純；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110739-201115）和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110738-200308）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

1）藥典規(guī)定條件

采用 Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-磷酸氫二鈉（0.1mol·L-1）溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 7）（35：65）；柱溫為 35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm。理論板數(shù)按異補(bǔ)骨脂素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[1]。

2）改進(jìn)條件

采用 Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-甲酸（0.1）%水溶液，采用梯度洗脫：0～5 min，65：35；5～20 min；55：45；20～35 min，45：55；35 min 以后，35：65；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm。理論板數(shù)按異補(bǔ)骨脂素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

1.3.2 待測(cè)溶液的制備

1）對(duì)照品溶液的制備 精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品7.40 mg，異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品6.60 mg，加甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中。制成質(zhì)量濃度為補(bǔ)骨脂素 37 μg·mL-1；異補(bǔ)骨脂素 33 μg·mL-1對(duì)照品溶液[1,7]。

2）供試樣品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取樣品粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，冷浸1 h，超聲處理（功率400 W，頻率50 kHz）45 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[1,7]。

1.3.3 重復(fù)性考察

取1.3.2步驟2）樣品共6份，精密稱定，分別按1.3.2項(xiàng)下供試樣品制備方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，考察該方法的重現(xiàn)性。

1.3.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取質(zhì)量濃度為37 μg·mL-1的補(bǔ)骨脂素和33 μg·mL-1的異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液各 1、5、10、15、20 mL 置于 25 mL 容量瓶中加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，在1.3.1色譜條件下考察其線性關(guān)系。

1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察該方法的精密度。

1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液分別在 0，2，4，6，8，10，12 h測(cè)定其含量，考察該方法一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.3.7 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取已測(cè)得含量的樣品1.0 g，共6份，分別精密加入補(bǔ)骨脂素對(duì)照品與異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品。參照1.3.2項(xiàng)下供試品溶液同法制備，按1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察該方法的加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照1.3.1色譜條件和樣品制備方法進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。從表1可見，補(bǔ)骨脂素含量的RSD為0.98%；異補(bǔ)骨脂素含量的RSD為1.31%，結(jié)果表明樣品重復(fù)性良好。

表1 腰痛片補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的重復(fù)性

2.1.2 線性關(guān)系

精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Yb=0.000 118 358X-0.344 727，r2=0.999 9；Yy=0.000 120 346X-0.944 223，r2=0.9993，表明補(bǔ)骨脂素對(duì)照品的進(jìn)樣量在0.37～7.40 μg，異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品的進(jìn)樣量在0.33～6.60 μg，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度

由表2可見，精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)針6次，考察其峰面積，結(jié)果6次補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD為0.96%，異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD為0.33%，表明該方法的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

由表3可見，12 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性，補(bǔ)骨脂素的RSD為0.78%，異補(bǔ)骨脂素的RSD為0.64%，說(shuō)明該方法在12h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

由表4可以看出，補(bǔ)骨脂素平均加樣回收率為100.0%，RSD為2.04%；異補(bǔ)骨脂素97.3%，RSD為0.81%，表明該方法回收率良好。

表2 腰痛片補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的精密度

表3 腰痛片補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的穩(wěn)定性

表4 腰痛片補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素加樣的回收率

2.2 色譜條件優(yōu)化

按照藥典規(guī)定的色譜條件和優(yōu)化之后的色譜條件，分別各進(jìn)樣一次，測(cè)得結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，色譜條件優(yōu)化之后補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素色譜峰與其它雜質(zhì)峰分離效果較好，而且在20 min內(nèi)即可完成，相比藥典規(guī)定的色譜條件出峰時(shí)間大為縮短。

圖1 腰痛片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素HPLC圖

2.3 樣品含量的測(cè)定

分別測(cè)定6份樣品當(dāng)中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，結(jié)果見表5。由表5可見，該6批次腰痛片中補(bǔ)骨脂素含量均高于0.37 mg·g-1，異補(bǔ)骨脂素含量均高于 0.35 mg·g-1， 二者 RSD 分別 為 1.04%和 1.28%。

表5 腰痛片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量

3 討論與結(jié)論

采用 C18柱，以甲醇-甲酸（0.1%）水溶液作為流動(dòng)相， 采用梯度洗脫：0～5 min，65：35；5～20 min；55：45；20～35 min，45：55；35 min 以后，35：65；檢測(cè)柱溫和波長(zhǎng)分別為35℃和246 nm。

通過(guò)對(duì)藥典規(guī)定的色譜條件加以優(yōu)化，不僅可以大大縮短含量分析檢測(cè)時(shí)間，而且還能夠在很大程度上緩解鹽溶液等有腐蝕性的流動(dòng)相對(duì)儀器管路的腐蝕與阻塞，這對(duì)提高操作效率和儀器使用率大有幫助[8-9]。本研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的方法結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，節(jié)約時(shí)間，重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)便可行，易于操作。