王艷萍，陳雪琴

（陜西省商洛市藥品檢驗所，陜西商洛 726000）

腰痛片為2015版中國藥典收載的成方制劑[1]，主要由杜仲葉、補骨脂、續(xù)斷、當(dāng)歸、白術(shù)、牛膝、肉桂、乳香、狗脊、赤芍、澤瀉、土鱉蟲等十二味中藥組成，具有補腎活血，強筋止痛之功效[2]。用于腎陽不足、淤血阻絡(luò)所致的腰痛及腰肌勞損等癥[1,3]。補骨脂作為其強筋骨的主要組方，對其有效成分進行快速測定就顯得很有必要。陳瑩等[4]綜述補骨脂化學(xué)成分主要有香豆素類、單萜類、黃酮類以及甾醇類，而香豆素類組分主要是補骨脂素、異補骨脂素和甲氧補骨脂素。2010版中國藥典一部腰痛片中補骨脂含量測定方法為高效液相色譜法[5]，流動相采用的是甲醇-磷酸氫二鈉（0.1 mol·L-1）溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至7），二者比例為35：65，測定處方中補骨脂有效成分補骨脂素和異補骨脂素。然而，采用該流動相測定樣品時，出峰時間大多在50 min以后，時間太長。同時，由于該流動相中引入了鹽溶液，整個流路系統(tǒng)容易堵塞，從而影響工作進度[6]?；诖?，本文對中藥復(fù)方腰痛片中補骨脂素和異補骨脂素含量測定方法進行優(yōu)化，以期建立一種快速有效的測定腰痛片中有效成分的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀，購自日本島津公司；BS224S電子分析天平（d=0.01 mg）和BT125D電子分析天平（d=0.01 mg），購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1801/1801PC紫外可見分光光度計，購自上海譜析儀器有限公司；SCS-1B純水機，購自北京先鋒威驅(qū)技術(shù)開發(fā)公司；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗儀，購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑

色譜級乙腈、甲醇（美國Sigma-Aidrich公司），磷酸氫二鈉（天津市百世化工有限公司）、磷酸（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（天津市紅巖化學(xué)試劑廠）等均為優(yōu)級純；補骨脂素對照品（中國食品藥品檢定研究院，110739-201115）和異補骨脂素對照品（中國食品藥品檢定研究院，110738-200308）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

1）藥典規(guī)定條件

采用 Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-磷酸氫二鈉（0.1mol·L-1）溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 7）（35：65）；柱溫為 35 ℃；檢測波長246 nm。理論板數(shù)按異補骨脂素峰計算應(yīng)不低于5 000[1]。

2）改進條件

采用 Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-甲酸（0.1）%水溶液，采用梯度洗脫：0～5 min，65：35；5～20 min；55：45；20～35 min，45：55；35 min 以后，35：65；柱溫：35℃；檢測波長246 nm。理論板數(shù)按異補骨脂素峰計算應(yīng)不低于5 000。

1.3.2 待測溶液的制備

1）對照品溶液的制備 精密稱取補骨脂素對照品7.40 mg，異補骨脂素對照品6.60 mg，加甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中。制成質(zhì)量濃度為補骨脂素 37 μg·mL-1；異補骨脂素 33 μg·mL-1對照品溶液[1,7]。

2）供試樣品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取樣品粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，冷浸1 h，超聲處理（功率400 W，頻率50 kHz）45 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1,7]。

1.3.3 重復(fù)性考察

取1.3.2步驟2）樣品共6份，精密稱定，分別按1.3.2項下供試樣品制備方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進行重復(fù)測定，考察該方法的重現(xiàn)性。

1.3.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取質(zhì)量濃度為37 μg·mL-1的補骨脂素和33 μg·mL-1的異補骨脂素對照品溶液各 1、5、10、15、20 mL 置于 25 mL 容量瓶中加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取上述對照品溶液10 μL，在1.3.1色譜條件下考察其線性關(guān)系。

1.3.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，考察該方法的精密度。

1.3.6 穩(wěn)定性實驗

取同一樣品溶液分別在 0，2，4，6，8，10，12 h測定其含量，考察該方法一定時間內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.3.7 加樣回收實驗

取已測得含量的樣品1.0 g，共6份，分別精密加入補骨脂素對照品與異補骨脂素對照品。參照1.3.2項下供試品溶液同法制備，按1.3.1色譜條件進行測定，考察該方法的加樣回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 重復(fù)性實驗

按照1.3.1色譜條件和樣品制備方法進行重復(fù)實驗，結(jié)果如表1所示。從表1可見，補骨脂素含量的RSD為0.98%；異補骨脂素含量的RSD為1.31%，結(jié)果表明樣品重復(fù)性良好。

表1 腰痛片補骨脂素和異補骨脂素的重復(fù)性

2.1.2 線性關(guān)系

精密吸取上述對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下測定峰面積，以峰面積（Y）對對照品進樣量（X，μg）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Yb=0.000 118 358X-0.344 727，r2=0.999 9；Yy=0.000 120 346X-0.944 223，r2=0.9993，表明補骨脂素對照品的進樣量在0.37～7.40 μg，異補骨脂素對照品的進樣量在0.33～6.60 μg，與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度

由表2可見，精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進針6次，考察其峰面積，結(jié)果6次補骨脂素峰面積的RSD為0.96%，異補骨脂素峰面積的RSD為0.33%，表明該方法的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗

由表3可見，12 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性，補骨脂素的RSD為0.78%，異補骨脂素的RSD為0.64%，說明該方法在12h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收實驗

由表4可以看出，補骨脂素平均加樣回收率為100.0%，RSD為2.04%；異補骨脂素97.3%，RSD為0.81%，表明該方法回收率良好。

表2 腰痛片補骨脂素和異補骨脂素的精密度

表3 腰痛片補骨脂素和異補骨脂素的穩(wěn)定性

表4 腰痛片補骨脂素和異補骨脂素加樣的回收率

2.2 色譜條件優(yōu)化

按照藥典規(guī)定的色譜條件和優(yōu)化之后的色譜條件，分別各進樣一次，測得結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，色譜條件優(yōu)化之后補骨脂素和異補骨脂素色譜峰與其它雜質(zhì)峰分離效果較好，而且在20 min內(nèi)即可完成，相比藥典規(guī)定的色譜條件出峰時間大為縮短。

圖1 腰痛片中補骨脂素和異補骨脂素HPLC圖

2.3 樣品含量的測定

分別測定6份樣品當(dāng)中補骨脂素和異補骨脂素的含量，結(jié)果見表5。由表5可見，該6批次腰痛片中補骨脂素含量均高于0.37 mg·g-1，異補骨脂素含量均高于 0.35 mg·g-1， 二者 RSD 分別 為 1.04%和 1.28%。

表5 腰痛片中補骨脂素和異補骨脂素的含量

3 討論與結(jié)論

采用 C18柱，以甲醇-甲酸（0.1%）水溶液作為流動相， 采用梯度洗脫：0～5 min，65：35；5～20 min；55：45；20～35 min，45：55；35 min 以后，35：65；檢測柱溫和波長分別為35℃和246 nm。

通過對藥典規(guī)定的色譜條件加以優(yōu)化，不僅可以大大縮短含量分析檢測時間，而且還能夠在很大程度上緩解鹽溶液等有腐蝕性的流動相對儀器管路的腐蝕與阻塞，這對提高操作效率和儀器使用率大有幫助[8-9]。本研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的方法結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，節(jié)約時間，重現(xiàn)性好，簡便可行，易于操作。