吳蕾蕾，徐 亞，劉 紅

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，江蘇226001）

慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）是克隆性骨髓增生性疾病，其特征在于第9號(hào)和第22號(hào)染色體長(zhǎng)臂斷裂、平行交叉易位，產(chǎn)生Ph染色體，導(dǎo)致具有酪氨酸激酶活性、促進(jìn)髓系細(xì)胞增殖失控的BCR-ABL融合蛋白形成[1]。酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）被認(rèn)為是CML治療的金標(biāo)準(zhǔn)，其中甲磺酸伊馬替尼（IM）可使80%初發(fā)CML患者獲得完全細(xì)胞遺傳學(xué)和血液學(xué)反應(yīng)。然而，隨著TKIs的廣泛應(yīng)用，耐藥問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，阻礙了療效，使得加速期或急變期患者增加，20%～25%IM治療患者中可觀察到IM耐藥和疾病進(jìn)行性進(jìn)展的分子學(xué)證據(jù)[2-3]。

蛋白質(zhì)泛素化在各種細(xì)胞進(jìn)程中起重要作用。蛋白質(zhì)被E2-E3泛素連接酶復(fù)合物泛素化，并被靶蛋白酶體降解，或其活性被特異性地改變。泛素化還影響調(diào)節(jié)許多控制造血功能的重要蛋白質(zhì)的活性。Triad1，也稱為ARIH2，是一種泛素連接酶，在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分化過(guò)程中高度表達(dá)[4-5]。Triad1及其結(jié)合蛋白參與骨髓集落形成和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。K48或K63連接的泛素鏈與Triad1以及Ubc7或Ubc13（E2連接酶）的相互作用有關(guān)[6-7]。EGF-R和GHR在上皮細(xì)胞中的溶酶體降解也涉及Triad1[8]。此外，Triad1促進(jìn)MDM2在各種細(xì)胞類型中蛋白酶體降解，可以抑制MDM2降解p53[9]。Triad1位于染色體3p21上，曾有AML和CML中該區(qū)域缺失的報(bào)道[10-11]。還有研究表明，Triad1在p53-MDM2軸上起作用，并且可作為一種新的調(diào)節(jié)因子[12]。

研究表明，Triad1功能與許多癌癥如AML和APL相關(guān)，但在CML以及CML耐藥中的作用尚未闡明。本研究以慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Triad1可以抑制K562細(xì)胞增殖，在耐藥K562細(xì)胞中Triad1表達(dá)減少，并探討了相關(guān)機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 伊馬替尼耐藥細(xì)胞K562R的建立 將K562細(xì)胞從0.05 μmol/L IM初始濃度開(kāi)始培養(yǎng)，然后每周以2倍增加藥物濃度，使終濃度達(dá)到3.2 μmol/L。為保持選擇壓力，維持抗性細(xì)胞在1 μmol/L IM下培養(yǎng)，全程約需6個(gè)月。以不同濃度IM分別處理K562細(xì)胞和K562細(xì)胞24h，CCK8檢測(cè)IC50值，評(píng)估對(duì)細(xì)胞的毒性作用，顯示K562與K562R細(xì)胞IC50比為85∶1，證實(shí)K562R耐藥模型構(gòu)建成功，其對(duì)IM維持較高水平耐藥性。

1.2 shRNA的制備和轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，平鋪至6孔板，37℃培養(yǎng)，至細(xì)胞密度60%～80%時(shí)，取5 μL Lipo 2000與0.5 mL Opti-MEM培養(yǎng)基反應(yīng)，混勻靜置 5 min。取 8～10 μL shRNA 與 0.5 mL Opti-MEM培養(yǎng)基反應(yīng)，混勻靜置5 min?；旌蟬hRNA和Lipo 2000，輕輕搖勻，靜置20 min。將混合物加入孔板中，輕混勻，加基培至2 mL，孵育6h后更換成完培。培養(yǎng)48～72 h后，在2 μg/mL嘌呤霉素存在下選擇表達(dá)shRNA的穩(wěn)定克隆。每3～5天用新鮮的含有嘌呤霉素培養(yǎng)基代替培養(yǎng)物，然后挑取并繼續(xù)傳代抗性細(xì)胞。收獲細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。

1.3 Western Blot檢測(cè) 收集細(xì)胞，冰上裂解20～30 min，置 4℃離心機(jī)，12 000 r/min，20 min，取上清液，以 4∶1體積與 SDS-PAGE 蛋白上樣（5×）緩沖液混合。取適量上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，cyclinE、CDK2、PCNA、caspase-3、p53、MDM2 一抗孵育，4℃過(guò)夜，搖床洗滌。室溫二抗孵育2h，洗滌后顯影液A液、B 液（1∶1）混勻，避光滴入顯影劑，孵育 1～2 min，多次曝光拍照。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，70%乙醇固定超過(guò)24h。離心后，加入 500 μL細(xì)胞周期試劑（Beyotime）充分混合，37℃避光溫育20 min，收集約10 000個(gè)細(xì)胞上流式細(xì)胞儀。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) K562細(xì)胞用冷PBS洗滌3次，重懸于緩沖液（BioLegend，San Diego，CA，USA）中，取 100 μL 細(xì)胞懸液加入 5 μL AnnexinV-FITC混勻，再加 5 μL 碘化丙錠（PI）混勻，室溫避光 15min，再加入400 μL緩沖液后上流式細(xì)胞儀。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料兩組間差異性比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Triad1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制K562細(xì)胞增殖為了探討Triad1和K562細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，先將K562細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)（S）72 h，再加入10%FBS（R），收集不同時(shí)間點(diǎn)（6 h、12 h、24 h、48 h）細(xì)胞。流式細(xì)胞儀測(cè)定顯示，與S 72 h相比，加入血清后G1期細(xì)胞比例逐漸減少，S期細(xì)胞逐漸增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示血清喂養(yǎng)使阻滯在G1期的細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)了G1/S期的轉(zhuǎn)化。見(jiàn)圖1（見(jiàn)封二）。Westernblot分析顯示，血清再喂養(yǎng)后Triad1表達(dá)逐漸下降，同時(shí)伴隨cyclinE、CDK2、PCNA的上調(diào)，提示Triad1可能在抑制K562細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。見(jiàn)圖2A（見(jiàn)封二）。

2.2 敲除Triad1對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響K562細(xì)胞用Triad1 shRNA及其各自對(duì)照轉(zhuǎn)染，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定克隆。Western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照以及其他2種Triad1 shRNA比較，shTriad1-1對(duì)Triad1表達(dá)的干擾效果最好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2B，見(jiàn)封二），因此選擇 shTriad1-1進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，干擾Triad1的K562細(xì)胞G1期明顯降低，S期細(xì)胞增多（圖2C，見(jiàn)封二），凋亡細(xì)胞減少（圖2D，見(jiàn)封二）。

2.3 Triad1表達(dá)與K562細(xì)胞耐藥相關(guān) Westernblot分析顯示，K562R耐藥細(xì)胞Triad1蛋白表達(dá)水平明顯減少，同時(shí)活化caspase-3和活化PARP凋亡標(biāo)志蛋白明顯減少，而MDM2蛋白表達(dá)增加。見(jiàn)圖3。推測(cè)Triad1可能通過(guò)調(diào)節(jié)p53和MDM2表達(dá)，與K562細(xì)胞的耐藥相關(guān)。

圖1 K562細(xì)胞饑餓培養(yǎng)72小時(shí)以及血清喂養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期

圖2 敲除Triad1對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖3 K562和K562R細(xì)胞Triad1及相關(guān)蛋白檢測(cè)

3 討 論

TKIs的應(yīng)用極大改變了CML患者的預(yù)后，IM治療患者的10年總生存率（OS）為82%，接近正常人群。在新發(fā)CML慢性期患者中，IM治療12個(gè)月后完全血液學(xué)緩解率97%，完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解率63%，僅7%患者進(jìn)入加速期或者急變期?？朔蘒M耐藥已成為目前主要的挑戰(zhàn)，為此必須進(jìn)一步了解IM耐藥的相關(guān)分子機(jī)制。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)Triad1與急性白血病密切相關(guān)，但是Triad1在CML中究竟發(fā)揮什么樣作用仍然未知。本研究首先探討了Triad1在K562細(xì)胞中的生物學(xué)功能及可能機(jī)制，饑餓釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Triad1在抑制K562細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。細(xì)胞增殖通常與細(xì)胞周期密不可分，因此進(jìn)一步探討Triad1是否是通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)抑制K562細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，Triad1干擾后，K562處于G1期的細(xì)胞明顯減少，同時(shí)PCNA等蛋白表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，我們還檢測(cè)了P53以及MDM2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Triad1參與P53-MDM2軸。綜上所述，我們的研究提示，Triad1主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及IM介導(dǎo)的耐藥中發(fā)揮作用。

Triad1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制K562增殖的具體機(jī)制及信號(hào)通路目前尚不清楚，在增殖的K562細(xì)胞中，Triad1低表達(dá)導(dǎo)致G1期細(xì)胞停滯減少。Triad1是一種E3泛素連接酶，泛素蛋白酶體系統(tǒng)與正常和惡性血細(xì)胞生成密不可分，三個(gè)酶家族發(fā)揮協(xié)同作用[13]。TRIAD1在調(diào)節(jié)骨髓祖細(xì)胞增殖、NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)和膜運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用[8，13-14]。p53蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、衰老、DNA修復(fù)和存活的轉(zhuǎn)錄因子，在造血系統(tǒng)中調(diào)節(jié)正常造血干細(xì)胞的自我更新[15]。在IM耐藥細(xì)胞K562R中，在Triad1低表達(dá)的同時(shí)，P53表達(dá)減少，猜測(cè)Triad1以p53依賴方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

總之，Triad1可作為一種重要的白血病調(diào)控因子，在CML細(xì)胞株的增殖和IM耐藥中發(fā)揮作用，敲減Triad1可促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少凋亡。本研究結(jié)果有助于理解Triad1在CML中的作用，并為改善CML的治療提供理論依據(jù)。

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