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        鐵皮石斛對免疫抑制模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖的影響

        2018-08-01 02:03:18陳星星楊小燕楊守深林福新
        中國獸醫(yī)雜志 2018年4期
        關(guān)鍵詞:鐵皮免疫抑制石斛

        陳星星, 李 焰, 楊小燕, 楊守深, 林福新

        (1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 福建 龍巖 364012 ; 2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心, 福建 龍巖 364012)

        隨著畜禽疾病的復(fù)雜性和多樣性逐漸增加,養(yǎng)殖生產(chǎn)中為了防控疾病和提高生產(chǎn)性能,出現(xiàn)大量使用以抗生素為主的飼料添加劑、不合理免疫接種等問題,導(dǎo)致畜產(chǎn)品藥物殘留、免疫功能下降、耐藥性增加,從而影響人類健康,同樣給我國畜牧業(yè)造成的損失日趨嚴(yán)重。中藥免疫增強(qiáng)劑由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成分多樣和具備內(nèi)在的多功能性,符合畜禽機(jī)體臟腑功能的相互協(xié)調(diào)和整體統(tǒng)一規(guī)律,能增強(qiáng)動物機(jī)體的免疫功能和提高生產(chǎn)力,并且部分兼?zhèn)錉I養(yǎng)性作用功能較全面[1]。帥起義等[2]研究表明,中藥免疫增強(qiáng)劑具有提升豬瘟疫苗免疫抗體的顯著作用,提高豬群生產(chǎn)性能,是預(yù)防免疫抑制疾病的重要手段。張桂枝等[3]結(jié)果表明,復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)雛雞免疫器官的發(fā)育,增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。耿文學(xué)等[4]以VA5免疫增強(qiáng)劑顯著提升豬偽狂犬病病毒滅活疫苗的免疫效果,對豬偽狂犬病滅活疫苗的免疫具有增強(qiáng)作用。

        鐵皮石斛是我國名貴中藥,載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,又名黑節(jié)草、鐵吊蘭等。味甘,平,無毒。主傷中,除痹,強(qiáng)陰。久服厚腸胃,輕身延年之功效[5]?,F(xiàn)代研究表明,其富含多糖、生物堿、微量元素和氨基酸等多種有效成分,主要有增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)消化、抗疲勞、抗肝損傷、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。脾臟是機(jī)體T、B淋巴細(xì)胞聚集的部位[6]。而T、B淋巴細(xì)胞是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞,其分裂、增殖在機(jī)體發(fā)揮免疫系統(tǒng)功能上有著重要的作用[7]。鐵皮石斛有補(bǔ)肝悅脾之功效,對免疫力也有提高作用。因此本試驗研究鐵皮石斛對免疫抑制模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖的影響,為將其開發(fā)為畜禽免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 藥物配制 100 g鐵皮石斛脫水曬干枝條,藥材質(zhì)量符合中華人民共和國獸藥典(2005年版)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。采用傳統(tǒng)水煎法:蒸餾水預(yù)先浸泡2 h,加熱煎煮2次,第1次保持微沸30 min,過濾藥液;藥渣加溫水再煮沸,保持微沸30 min,過濾藥液;合并兩次濾液,小火濃縮至1.0 g/mL(按照生藥量計算)。于60目篩網(wǎng)過濾、裝瓶、高壓滅菌,于-20 ℃冰箱保存。

        1.1.2 環(huán)磷酰胺的配制 將0.2 g環(huán)磷酰胺粉末與生理鹽水按100 mg/kg進(jìn)行稀釋。

        1.1.3 試驗試劑 刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS),購自Sigma公司;胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、RPMI-1640培養(yǎng)基、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基偶氮唑鹽(MTT),購自Gibco公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、氯化銨(NH4Cl)等均為國產(chǎn)分析純試劑。青鏈霉素,購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

        1.1.4 主要設(shè)備 SW-CJ-1F型超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;T-DH型倒置顯微鏡,日本Nihon Kohden公司;3111型二氧化碳培養(yǎng)箱,美國Thermo公司;酶標(biāo)儀,美國Thermo公司。

        1.2 方法

        1.2.1 實驗動物及分組 6周齡清潔級KM小鼠50只,體重18~22 g,全為雌性,購自上海斯萊克實驗動物有限公司。隨機(jī)分為對照組、免疫抑制組,每組25只。每組各設(shè)5個重復(fù),每個重復(fù)5只小鼠。對照組給予腹腔注射等量的生理鹽水,免疫抑制組給予腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液(100 mg/kg·bw)。

        對照組與免疫抑制組隔天分別注射生理鹽水和環(huán)磷酰胺注射液,1日1次,劑量為100 mg/kg·bw,連續(xù)15 d,末次給藥后取對照組和免疫抑制組的小鼠各2只,將小鼠空腹12 h之后,脫頸處死,75%酒精浸泡5 min,無菌取脾,放在盛有適量PBS的培養(yǎng)皿中,小心剪除脂肪與筋膜組織,置于200目篩網(wǎng)上,用無菌注射針針芯輕輕研磨,使細(xì)胞濾過篩網(wǎng),收集細(xì)胞懸液,加入3 mL Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞,室溫靜置5 min,1 500 r/min離心10 min,棄去上清,用RPMI-1640培養(yǎng)液離心洗滌細(xì)胞2次,以除去剩余的Tris-NH4Cl。收集細(xì)胞懸液即為脾淋巴細(xì)胞。運(yùn)用臺盼藍(lán)染色統(tǒng)計細(xì)胞活力。

        1.2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)

        1.2.2.1 鐵皮石斛對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用最佳濃度及最佳時間的選擇 顯微鏡計數(shù),使用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞稀釋成2×106個/mL,分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,加入不同濃度的鐵皮石斛,最終體積均為200 μL/孔,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后向每孔加入10 μL MTT反應(yīng)4 h,棄上清,再向各孔加入150 μL DMSO,混勻,靜置5 min,最后酶標(biāo)儀測定OD570mm值。

        1.2.2.2 鐵皮石斛于體外對ConA/LPS介導(dǎo)的小鼠T/B淋巴細(xì)胞增殖的影響 分別將小鼠脾細(xì)胞懸液按照100 μL/孔加入到96孔板中。各樣本設(shè)ConA孔、LPS孔、對照孔。ConA孔加入2 μL ConA(最終濃度為10 μg/mL),LPS孔加入2 μL LPS(最終濃度為100 μg/mL),對照孔不加入鐵皮石斛,最終體積均為200 μL/孔。按照1.2.2.1方法培養(yǎng)細(xì)胞,MTT法測定各培養(yǎng)孔OD570mm值。

        1.2.3 細(xì)胞增殖測定方法 采用MTT法測定細(xì)胞增殖情況,即在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h后,每孔加入10 μL的MTT,繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,吸棄上清,最后加入DMSO 150 μL/孔,混勻,靜置5 min,于570nm波長測定OD值。

        1.2.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan′s多重比較及配對樣本t檢驗(置信區(qū)間95%),結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,以P<0.05為差異顯著,P>0.05表明數(shù)據(jù)差異不顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 鐵皮石斛對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 由表1可知,不同作用濃度分析表明,鐵皮石斛在終質(zhì)量濃度5~405 μg/mL范圍內(nèi)均可促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖,并且表現(xiàn)量效關(guān)系,其中在5~135 μg/mL范圍內(nèi)促進(jìn)效果顯著(P<0.05)。不同作用時間分析表明,在不同濃度鐵皮石斛刺激24、48、72 h 后,小鼠脾臟淋巴細(xì)胞均有增殖,其中作用48 h增殖幅度最大,表明鐵皮石斛作用48 h對淋巴細(xì)胞的增殖效果顯著(P<0.05)。

        表1 鐵皮石斛對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用最佳濃度及最佳時間的選擇

        注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05),下表同

        2.2 不同濃度鐵皮石斛對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響 由表2可知,培養(yǎng)48 h后,對于免疫抑制組而言,在濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的鐵皮石斛協(xié)同ConA刺激免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分裂增殖情況具有顯著作用(P<0.05),其中鐵皮石斛濃度在20 μg/mL時最佳。從對照組來看,20 μg/mL鐵皮石斛濃度與單純ConA刺激正常小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖效果差異不顯著(P>0.05)。對照組中,不同濃度的鐵皮石斛組間進(jìn)行比較,各組間均差異顯著(P<0.05),并在一定濃度范圍內(nèi),隨鐵皮石斛濃度的增高,細(xì)胞分裂增殖效果有增加趨勢。

        表2 不同濃度鐵皮石斛對免疫抑制、對照小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響

        2.3 不同濃度鐵皮石斛對小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響 由表3可知,培養(yǎng)48 h后,對于免疫抑制組而言,不同濃度的鐵皮石斛+LPS組與LPS組單純刺激相比差異顯著(P<0.05),各濃度鐵皮石斛OD值均高于單純LPS刺激。提示在體外培養(yǎng)條件下鐵皮石斛能很好的協(xié)同LPS刺激免疫抑制小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖,以40 μg/mL濃度效果最佳。對于對照組而言,不同濃度的鐵皮石斛進(jìn)行組間比較,各組間均差異不顯著(P>0.05),不同濃度的鐵皮石斛對LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞分裂增殖效果顯著(P<0.05)。

        表3 不同濃度鐵皮石斛對免疫抑制、對照小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響

        3 討論

        本試驗通過參考文獻(xiàn)和預(yù)試驗選擇以100 mg/kg·bw,腹腔注射環(huán)磷酰胺,一日一次,隔天注射,連續(xù)15 d的方法建立免疫抑制模型小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠體重減輕、飲食減少、精神沉郁、行動遲緩等免疫抑制癥狀,與李焰等[8]報道相符。表明免疫抑制模型小鼠建立成功。

        脾臟是體內(nèi)最大的外周淋巴器官,含有大量的淋巴細(xì)胞,其中T淋巴細(xì)胞占35%~50%,B淋巴細(xì)胞占50%~65%,兩者分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞的增殖情況能直觀的反映出機(jī)體免疫功能[9]。Con A 、LPS分別作為T 、B淋巴細(xì)胞的有絲分裂原,主要促進(jìn)兩者增殖與分化為淋巴母細(xì)胞,最終產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。本試驗采用MTT法檢測脾臟淋巴細(xì)胞的分裂增殖情況,MTT法于1983年首創(chuàng),由Mosmann應(yīng)用于鼠淋巴瘤細(xì)胞中研究IL-2等細(xì)胞因子對細(xì)胞存活和增殖的影響,MTT法具有重復(fù)性好、靈敏性高、操作簡便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[10-11],現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。胡庭俊等[12]運(yùn)用MTT法測定細(xì)胞的增殖程度,研究發(fā)現(xiàn),山豆根多糖能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和分泌NO的作用。劉民等[13]在37 ℃培養(yǎng)條件下用MTT法檢測小鼠淋巴細(xì)胞增殖。

        本次試驗選取5個濃度梯度在不同培養(yǎng)時間條件下觀察鐵皮石斛對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響,由試驗結(jié)果可知,鐵皮石斛終質(zhì)量濃度在5~135 μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞增殖作用顯著(P<0.05)。作用48 h效果最為明顯。因此本試驗選取20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL三個濃度作為探討鐵皮石斛協(xié)同ConA、LPS刺激小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞體外作用的最佳濃度。對于小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞而言,3個鐵皮石斛濃度均能促進(jìn)免疫抑制組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.05),其中濃度為20 μg/mL時,小鼠淋巴細(xì)胞的增值效果最佳,表明鐵皮石斛能夠協(xié)同ConA促進(jìn)免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖,增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。對照組中,不同濃度的鐵皮石斛組間進(jìn)行比較,各組間均差異顯著(P<0.05),并在一定濃度范圍內(nèi),隨鐵皮石斛濃度的增高,細(xì)胞分裂增殖效果有增加趨勢,鐵皮石斛濃度為80 μg/mL時對于正常小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分裂增殖顯著(P<0.05)。對于小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞而言,鐵皮石斛濃度為40 μg/mL時對免疫抑制小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖效果最佳。各濃度鐵皮石斛OD值均高于單純LPS刺激,且細(xì)胞增殖情況差異顯著(P<0.05),但對照組中三個鐵皮石斛濃度差異不顯著(P>0.05)。提示鐵皮石斛協(xié)同LPS促進(jìn)正常小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖,參與機(jī)體體液免疫,但最佳濃度還有待進(jìn)一步的研究。

        夏方等[14]研究發(fā)現(xiàn)是由地錦草、白頭翁和黃連3味中藥組方制成的地翁顆粒能促進(jìn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖。宋美芳等[15]研究結(jié)果表明,鐵皮石斛多糖在一定的濃度范圍內(nèi)能提高小鼠的免疫活性,促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌。以上學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)為本次試驗結(jié)果提供有力的佐證。

        綜上所述,在體外培養(yǎng)條件下,鐵皮石斛協(xié)同LPS、ConA促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞增殖,加強(qiáng)機(jī)體的免疫功能,為鐵皮石斛的開發(fā)成畜禽免疫增強(qiáng)劑提供基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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