申紅春

(恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

鴨大腸桿菌病是由特定致病性血清型大腸桿菌引起的鴨不同病型大腸桿菌病的總稱，該病的發(fā)病率和死亡率較高，臨床表現(xiàn)為急性敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎、臍炎等，是鴨養(yǎng)殖過程中的常見的細(xì)菌性傳染病之一。致病性大腸桿菌可感染不同階段的鴨，尤其是2～6周齡鴨最易感，發(fā)病率為25%～40 %，死亡率可達(dá)50%，該病主要通過呼吸道、生殖道感染和種蛋污染等多種途徑傳播[1-2]。中草藥具有低殘留、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽的養(yǎng)殖中。急性、亞慢性毒性試驗是用來評價新的藥物的研發(fā)和臨床使用的安全性，急性毒性試驗是驗證藥物在短期內(nèi)對試驗動物的毒性，對試驗動物1次或者24 h內(nèi)多次給藥，亞慢性毒性試驗是評價藥物對試驗動物長期使用毒性作用[3-4]。本試驗對篩選出來的抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑采用急性、亞慢性毒性試驗評價其使用的安全性，為復(fù)方中草藥制劑防治鴨致病性大腸桿菌臨床的安全使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 黃柏、甘草、板藍(lán)根、白頭翁、秦皮等中藥飲片，購自北京同仁堂大藥房恩施分店；按照相應(yīng)的比例組合后烘干超微粉碎，制備的復(fù)方中草藥制劑用滅菌水制成混懸液，濃度為500 mg/mL。

1.2 主要儀器與試劑 生化試劑盒谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)，均購自南京建成生物工程公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀、ND2000C型分光光度計，均由德國Thermo公司生產(chǎn)；常規(guī)的儀器和試劑由本實驗室提供。

1.3 試驗動物 1日齡的健康雛鴨240只，購自某養(yǎng)殖場，用不含中草藥添加劑和抗生素的全價日糧飼喂至14日齡進(jìn)行試驗。

1.4 急性毒性試驗 參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計試驗，將體重98 g±2 g的14日齡雛鴨90只，分成9組，每組10只，第1～8組通過灌胃的方式給藥2 mL，劑量分別0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 g/(kg·bw/d) 的復(fù)方中草藥制劑混懸液(濃度500 mg/mL)，9組給予等量的生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，記錄每個試驗組中毒時間、癥狀及死亡數(shù)量，并計算LD50。當(dāng)試驗結(jié)束后將試驗鴨撲殺，觀察體內(nèi)的組織器官的病變情況。

1.5 最大耐受量試驗 參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計試驗，將體重為98 g±2 g的14日齡雛鴨40只，分成4組，每組10只，1～3組通過灌胃的方式給藥2 mL，給藥劑量分別為5，15，25 g/(kg·bw/d) 的復(fù)方中草藥制劑混懸液(濃度500 mg/mL)，4組給予等量的生理鹽水，觀察7 d，記錄中毒時間、癥狀及死亡數(shù)量，試驗結(jié)束將試驗鴨撲殺，觀察組織器官的病理變化，并采集肝、腎等器官做組織病理學(xué)觀察。

1.6 亞慢性毒性試驗 參考文獻(xiàn)[7]，選擇14日齡體重大約98 g±2 g雛鴨80只，平均分成4組，每組20只，1組為對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，2～4組在基礎(chǔ)日糧添加20、40、80 g/(kg·bw/d)的復(fù)方中草藥制劑至42 d日齡，試驗結(jié)束后再飼養(yǎng)14 d。在試驗期間，給藥后的14 d，28 d進(jìn)行稱重，并隨機(jī)抽取5只雛雞采血后剖檢，以檢測肝、腎功能指標(biāo)和肝、腎等器官組織病理學(xué)變化，記錄每個試驗組的中毒時間、癥狀及死亡數(shù)量及相應(yīng)的病變情況。各個試驗組試驗雛鴨停藥后繼續(xù)觀察14 d，進(jìn)行稱重。

1.7 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，以(P<0.05) 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗結(jié)果 在急性毒性試驗中，各個試驗組的試驗雛鴨的采食與飲水均正常，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象及死亡情況，故計算不出LD50。試驗結(jié)束后，每個試驗組隨機(jī)抽取5只試驗雛鴨進(jìn)行剖檢，肝、腎等主要器官未出現(xiàn)明顯的病變。

2.2 最大耐受量試驗結(jié)果 在最大耐受量試驗中3個試驗組的試驗雛鴨采食與飲水均正常，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象及死亡情況。每個試驗組隨機(jī)抽取5只試驗雛鴨進(jìn)行剖檢未見明顯病理變化，肝、腎等主要器官病理組織學(xué)觀察，未見出現(xiàn)病變。試驗雛鴨的最大耐受量超過了25 g/(kg·bw/d)。

2.3 亞慢性試驗結(jié)果

2.3.1 臨床及病理觀察結(jié)果 在亞慢性毒性試驗中，各個試驗組未發(fā)生死亡，采食與飲水正常，未出現(xiàn)死亡的。每個試驗組隨機(jī)抽取5只試驗雛鴨進(jìn)行剖檢，肝、腎等主要器官未出現(xiàn)病變，其病理組織學(xué)觀察也未見異常變化。

2.3.2 體重的變化結(jié)果 由表1可見，在試驗后的第14天， 1組與2組試驗雛鴨的體重相比差異不顯著(P>0.05)，3組和4組的試驗雛鴨的體重與1組相比差異顯著(P<0.05)。在試驗后的28 d和停藥后的14 d，2組、3組、4組試驗雛鴨的體重與1組相比，差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表1 復(fù)方中草藥制劑對雛鴨體重的影響 (g)

注:同列數(shù)據(jù)小寫字母或者無字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)小寫字母不相同表示差異顯著(P<0.05)，下表同

3.3.3 肝、腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果 由表2可知，在試驗后的14 d、28 d，2組、3組、4組試驗雛鴨血清中的GPT、GOT的含量與1組相比，均無顯著差異(P>0.05)。

由表3可知，在試驗后的14 d、28 d，2～4組試驗雛鴨血清中的BUN含量呈下降趨勢，其中，2組、3組、4組與1組相比，差異顯著(P<0.05)，但2組、3組、4組之間差異不顯顯著(P>0.05)； 2組、3組、4組試驗雛鴨血清中的的UA的含量與1組相比，差異顯著 (P<0.05)，2組、3組、4組之間差異性不顯顯著(P>0.05)。

表2 復(fù)方中草藥制劑對雛鴨血清中GPT，GOT含量的影響 (mmol/L)

表3 不同濃度的復(fù)方中草藥超微粉對雛雞血清中BUN，UA含量的影響 (mmol/L)

3 討論

急性毒性試驗是短期內(nèi)對受試動物多次給藥，驗證其藥物的毒性，應(yīng)用于新的藥物的研發(fā)與安全性評價。本試驗對篩選出來的抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑，進(jìn)行了急性毒性試驗，評其使用的安全性。結(jié)果顯示，結(jié)果未檢LD50，最大耐受量試驗中，試驗雛鴨飲水與采食正常，未出現(xiàn)死亡情況，剖檢后肝、腎等主要器官未出現(xiàn)病變，且病理組織學(xué)觀察也無異常變化，抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑對雛鴨耐受量、給藥量超過了25 g/(kg·bw/d)，[相當(dāng)于復(fù)方中草藥生藥量25 g/(kg·bw/d)]。與張召興[7]報道的一致。

在亞慢性毒性試驗中，結(jié)果顯示，試驗雛鴨飲水與采食正常，未出現(xiàn)死亡情況，剖檢變化與病理組織學(xué)檢查也未見異常。在試驗后的14 d，3組和4組試驗雛鴨體重顯著低于1組，這可能由于飼料中添加復(fù)方中草藥制劑中藥，影響試驗雛鴨的采食量，因而影響試驗雛鴨的體重，在試驗后的28 d及停藥后的14 d，試驗組雛鴨體重與對照組比較無顯著的差異。與李應(yīng)超等[5]報道的一致。肝臟是體內(nèi)重要的解毒器官，當(dāng)肝臟受到損傷時，導(dǎo)致動物機(jī)體物質(zhì)代謝異常、紊亂等，血清中的GOT和GPT的含量增加。本試驗結(jié)果顯示，使用復(fù)方中草藥制劑后，血清中的GPT和GOT含量與對照組比較均無顯著差異，證實該制劑肝臟無損傷作用，與官麗輝等[8]，索朗扎西等[9]等報道的一致。腎臟是主要的排泄器官，血清中UA和BUN含量是腎功能主要的指標(biāo)[10]。本試驗結(jié)果顯示，試驗組雛鴨血清中的BUN、UA含量低于對照組，因而證實了該制劑對腎臟無損傷作用，可以提高雛鴨腎臟的代謝水平。與張召興[9]報道的一致。本試驗對抗鴨致病性大腸桿菌復(fù)方中草藥制劑在臨床中安全應(yīng)用提供參考依據(jù)。