王 婧， 李 沅， 劉 冉， 高 子 晴

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

我國是茶葉消耗大國，隨著茶葉深加工領(lǐng)域不斷發(fā)展，茶產(chǎn)品產(chǎn)量迅速增長，作為茶飲料的副產(chǎn)品，茶渣的年產(chǎn)量隨之迅速增加[1]。茶渣本身富含營養(yǎng)物質(zhì)，直接廢棄造成了資源浪費[2]。目前，茶渣的處理主要有兩種，一種是代替谷物等傳統(tǒng)原料制成動物飼料[3]，另一種是做成肥料[4]。由于茶渣中含有高濃度的咖啡因[5]，動物食用會導(dǎo)致其畜產(chǎn)品產(chǎn)量減少，用作土地肥料導(dǎo)致鹽堿化，影響種子萌發(fā)和作物生長。因此，快速有效地降解咖啡因成為茶渣利用技術(shù)的關(guān)鍵[6-7]。與化學(xué)和物理法去除咖啡因相比，微生物法具有操作簡單、去除率高、無毒無污染而且成本低廉等優(yōu)點，越來越受到人們的關(guān)注[8]。

本試驗從茶園土壤中篩選純化得到一株咖啡因高效降解菌株，對其進行鑒定，并對咖啡因降解條件進行優(yōu)化，確定茶渣降解的最優(yōu)條件，以期為微生物降解咖啡因的機理提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試土壤采自江蘇省鎮(zhèn)江市五女峰茶園(N32°19′64.58″，E119°25′10.34″)。

M9培養(yǎng)基：咖啡因0.15%，Na2HPO4·12H2O 6.4%，KH2PO41.5%，NH4Cl 0.5%，NaCl 0.25%，pH 5.0，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 咖啡因降解菌的分離與純化

稱取土壤樣品1 g放于50 mL含0.3 g/L咖啡因的M9培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h[9]。于4 000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL至于50 mL M9培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接3代后，將菌液進行稀釋涂布，待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取單菌落反復(fù)劃線進行純化。將純化后的菌株接種于含1.5 g/L咖啡因的M9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h后，利用HPLC法[10]測定上清液剩余咖啡因的量，計算各菌株咖啡因的降解率，篩選出降解能力最強的菌株。

1.2.2 菌種的鑒定

用試劑盒快速提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，16S rRNA 的通用引物(正向27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′，反向1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。 PCR體系(50 μL)：0.05 U/μL TakaRa Taq 0.6 μL，10×PCR Buffer(Mg2+) 5 μL，40 mmol/L dNTPs 4 μL，基因組DNA模板2 μL，10 μmmol/L正反向引物各1 μL，ddH2O 36.4 μL。PCR條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循環(huán)29次；72 ℃10 min；16 ℃恒溫。PCR產(chǎn)物的純化和測序由寶生物工程(大連)有限公司完成，將測序結(jié)果在GenBank進行序列比對及同源分析[11]。

1.2.3 HPLC法測定咖啡因含量

樣品預(yù)處理：待測樣品經(jīng)過10 000 r/min、4 ℃ 離心10 min后，取上清于4 ℃保存?zhèn)溆肹12]。

HPLC檢測條件：色譜柱，Hypersil C-18柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；紫外檢測波長254 nm；流動相：甲醇與水體積比30∶70；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃。

1.2.4 不同培養(yǎng)條件對菌株的影響

分別選取pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，溫度20、25、30、35、40 ℃、搖床轉(zhuǎn)速140、160、180、200、220 r/min、接種量1%、3%、5%、7%、9%，以不加對應(yīng)因子的試驗組為空白對照，培養(yǎng)36 h后進行測定[13]。

1.2.5 菌株對茶渣中咖啡因的降解

將含有1.5 g/L咖啡因的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 的菌株作為種子液，分別裝入9個含有100 mL 茶渣培養(yǎng)基的錐形瓶。分別加入無菌水，并接種5 mL種子液，將錐形瓶放入不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，待發(fā)酵到指定的時間后，取出檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 咖啡因降解菌的篩選及鑒定

經(jīng)分離和純化，得到一株咖啡因高效降解菌，命名為CF1。當咖啡因質(zhì)量濃度為1.5 g/L時，24 h菌株降解率達到了53.1%。菌株在LB平板上的菌落呈白色，圓形，凸起，表面潤澤，邊緣整齊，顯微鏡下細胞形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色陰性。菌株CF1的16S rRNA序列長度為1 493 bp，通過 BLAST序列同源性分析，菌株CF1與BurkholderiasediminicolaHU2-65W最為相似，相似度為98.4%。根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。CF1與B.sediminicolaHU2-65W和BurkholderiaaspalathiVGIC在同一分枝上。經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rRNA 基因測序與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，菌株CF1屬于Burkholderia屬。

2.2 降解條件對菌種生長和咖啡因降解率的影響

如圖2所示，CF1在pH 5.0～6.0生長狀況良好，對咖啡因降解能力最強；低于4.0或高于7.0，菌體生長能力弱，咖啡因降解能力也較低，因此確定CF1降解咖啡因的最適pH為5.0。菌株生長與咖啡因降解呈正相關(guān)。

如圖3所示，在20～30 ℃時，CF1菌體濃度和咖啡因降解率隨溫度的升高而增加；30～35 ℃時，菌體的OD最大，但菌濃度變化不大，培養(yǎng)基內(nèi)的咖啡因降解完全，這是菌體生長及咖啡因降解的最適溫度范圍；40 ℃時，菌體幾乎停止生長，咖啡因降解率為0。因此確定菌株CF1咖啡因降解的最適溫度為30 ℃。

如圖4所示，當轉(zhuǎn)速小于180 r/min時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，CF1的生長速率和對咖啡因的降解率有小幅度提高；但當轉(zhuǎn)速大于180 r/min后，其對菌株生長及咖啡因降解率影響不明顯。因此確定最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖1 菌株CF1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of strain CF1

圖2 pH對菌株CF1生長及咖啡因降解率的影響Fig.2 Effects of pH on CF1 growth and caffeine degradation

圖3 溫度對菌株CF1生長及咖啡因降解率的影響Fig.3 Effects of temperature on CF1 growth and caffeine degradation

圖4 轉(zhuǎn)速對菌株CF1生長及咖啡因降解率的影響Fig.4 Effects of rotation rate on CF1 growth and caffeine degradation

如圖5所示，當接種量大于3%時，其對CF1的生長及咖啡因降解影響不顯著。因此選擇最適接種量為5%。

圖5 接種量對菌株CF1生長及咖啡因降解率的影響
Fig.5 Effects of inoculation amount on CF1 growth and caffeine degradation

2.3 咖啡因降解條件的優(yōu)化

通過正交試驗設(shè)計方法優(yōu)化菌株對茶渣中咖啡因的降解，選取含水量、溫度、發(fā)酵時間3個因素，每個因素設(shè)3個水平進行分析，選取L9(34)正交設(shè)計表的前3列進行試驗，共進行9次試驗。正交試驗因素及水平見表1，方案及結(jié)果見表2。

由表2可以看出，正交設(shè)計的最優(yōu)組合是A1B2C2，即降解的最優(yōu)條件為含水量15 mL，溫度30 ℃，降解時間7 d，茶渣中咖啡因的降解率最高達到98.1%。

表1 正交試驗因素和水平Tab.1 The factors and levels of orthogonal test

表2 正交設(shè)計方案及結(jié)果Tab.2 The scheme and result of orthogonal design

由表3可以看出，溫度屬于一般顯著因素，含水量和時間為不顯著因素。茶渣的降解程度與時間成正比，時間因素不顯著的原因可能是選取的時間是茶渣降解后期，最少時間5 d時，茶渣的降解水平已經(jīng)達到較高水平，因此正交試驗結(jié)果時間不是顯著因素。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Tab.3 The variance analysis of the orthogonal experiment results

3 結(jié) 論

從茶園土壤中篩選出1株咖啡因高效降解菌株，該菌株為Burkholderia屬，與B.sediminicolaHU2-65W和B.aspalathiVGIC的親緣關(guān)系最近。咖啡因降解菌CF1在M9培養(yǎng)基中的最優(yōu)生長及降解條件為pH 5.0、30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 及接種量5%，其咖啡因的降解能力與菌株的生長在一定范圍內(nèi)成正比。正交試驗得到最佳發(fā)酵條件為溫度30 ℃、時間7 d、茶渣含水量75%，此時茶渣中咖啡因降解效果最佳。將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，可以有效去除茶渣中的咖啡因，生產(chǎn)出脫咖啡因飼料或肥料，對解決茶渣污染問題有重要意義。