沈?qū)毩迹钤骑w，韓擎天，高生，沈洪興，2，殷勇*

(1上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院，上海 201800；2上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海 200127)

慢性壓迫性頸脊髓病(chronic spinal cord disease，CSCD)是由于年齡增長，頸部骨質(zhì)增生、骨贅形成、椎間盤退化突出、后縱韌帶骨化、黃韌帶增生肥厚等多種原因造成的頸部脊髓長期受壓所產(chǎn)生的一系列臨床癥狀和體征[1-3]。建立科學(xué)有效的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以彌補(bǔ)該病在臨床工作中病理機(jī)制研究的不足。近年來對慢性壓迫性頸脊髓動物模型的研究對象主要集中在嚙齒類動物，大型動物的研究較少[4-6]。本實(shí)驗(yàn)以山羊?yàn)槟Ｐ蛣游铮捎靡环N新型的脊髓壓迫系統(tǒng)建立了慢性壓迫性頸脊髓動物模型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 10～12月齡的雌性崇明山羊12只(上海寶山區(qū)羅涇錫華實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場)，體重30～40 kg，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(9只)和對照組(3只)。實(shí)驗(yàn)組9只山羊在模型建立后的第4周、8周和12周時(shí)各處死2只，進(jìn)行病理檢測分析。

1.2 球囊壓迫裝置制作 取1根醫(yī)用兒童導(dǎo)尿管(8號)，將其前端固定在1枚醫(yī)用的聚乙烯螺釘內(nèi)，導(dǎo)尿管與螺釘間的縫隙用硅膠充填，實(shí)驗(yàn)前檢測無滲漏方可使用。螺釘規(guī)格：外側(cè)徑10 mm，內(nèi)側(cè)徑8 mm，以上各部分組成實(shí)驗(yàn)用的慢性球囊壓迫裝置(見圖1)。

a 未充盈前 b 充盈后

圖1 慢性球囊壓迫裝置

圖2 術(shù)中顯露C3水平硬膜囊

1.3 動物模型制作 造模手術(shù)前12 h，實(shí)驗(yàn)動物禁食、水，手術(shù)區(qū)域備皮，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行靜脈麻醉，氣管插管后將實(shí)驗(yàn)動物仰臥固定于手術(shù)臺上，頸后墊高固定，保持頸部中立。術(shù)前X線片透視定位，確定C3椎體，行頸前旁正中切口，逐層切開皮膚和皮下組織，分離保護(hù)頸動脈和氣管，暴露C3椎體及上下椎間隙。將定位針置于C3椎體再次透視確定無誤后，于C3椎體前正中用空心環(huán)鉆鉆出一直徑約8 mm的骨隧道，再用直徑10 mm的絲攻擴(kuò)大骨隧道，暴露硬膜囊(見圖2)。測深器確定骨隧道深度，將相同尺寸的聚乙烯螺釘球囊裝置慢慢擰入，確定螺釘無松動后逐層縫合切口，導(dǎo)尿管體部用絲線固定于皮膚上。術(shù)后每7天經(jīng)外置導(dǎo)尿管向球囊注射碘海醇造影劑0.1 mL，直至12周。對照組同實(shí)驗(yàn)組一樣安裝好球囊壓迫裝置，但術(shù)后不注射造影劑，每7天記錄一次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 脊髓運(yùn)動功能評分 術(shù)后采用Tarlov評分[7]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物脊髓運(yùn)動功能評分，5分：正常，可跳可跑；4分：能跑但不能跳；3分：能走但不能跑；2分：可站立，但不能走；1分：不能站立但肢體可以活動；0分：肢體完全癱瘓。

1.5 影像學(xué)評估 術(shù)后第4、8、12周行頸椎X線、CT檢查。術(shù)后X線片示球囊內(nèi)造影劑滲漏至椎管內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動物予以廢棄，同時(shí)補(bǔ)充相同量新的實(shí)驗(yàn)動物。

1.6 病理學(xué)檢測 對照組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，實(shí)驗(yàn)組在建模后第4、8、12周時(shí)各處死2只，取下實(shí)驗(yàn)動物C3椎體節(jié)段上下約3 cm的脊髓組織，常規(guī)石蠟切片，行HE染色，并在光鏡下觀察病理學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓運(yùn)動功能評分結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)中無實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)意外死亡情況。對照組在各觀察時(shí)間點(diǎn)脊髓運(yùn)動功能均正常。實(shí)驗(yàn)組在建模術(shù)后第4周，所有動物脊髓運(yùn)動功能均正常(Tarlov評分均為5分)；術(shù)后5、7、8周時(shí)，分別有1只不能跳躍，但能跑動(Tarlov評分均為4分)；術(shù)后第10周時(shí)，有2只動物出現(xiàn)不能跑，但可以走動(Tarlov評分分別為3分)，術(shù)后第11周時(shí)，又有1只動物出現(xiàn)不能跑動，但可以走(Tarlov評分分別為3分)，術(shù)后第12周時(shí)，有2只動物出現(xiàn)不能走動，但可以站立(Tarlov評分分別為2分)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，沒有動物出現(xiàn)肢體完全癱瘓。

2.2 影像學(xué)檢查結(jié)果 術(shù)后第4、8、12周分別行X線、CT檢查。影像學(xué)結(jié)果顯示：對照組脊髓未見明顯壓迫；實(shí)驗(yàn)組慢性球囊壓迫裝置穩(wěn)定，未見松動，球囊膨脹直徑從第1周1.0 mm逐漸增大至第12周5.8～6.4 mm(平均直徑6.1 mm)，隨著造影劑不斷注入，實(shí)驗(yàn)動物脊髓呈現(xiàn)逐漸受壓態(tài)勢。術(shù)后12周最后一次注射時(shí)，X線透視可見實(shí)驗(yàn)動物頸椎椎體序列良好，慢性球囊壓迫系統(tǒng)裝置固定確切(見圖3)；CT示球囊向椎管內(nèi)腹側(cè)壓迫(見圖4)。

2.3 病理學(xué)結(jié)果 H-E染色可見：對照組神經(jīng)元細(xì)胞、軸突和白質(zhì)正常(見圖5a、5b)；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周時(shí)病理學(xué)結(jié)果與對照組相同，未見明顯改變；但術(shù)后第8周時(shí)，顯微鏡下見受壓節(jié)段脊髓前角內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞變性，胞體出現(xiàn)萎縮變小，但數(shù)量未見明顯減少，部分白質(zhì)出現(xiàn)輕度脫髓鞘改變，部分軸突出現(xiàn)空泡樣變性(見圖5c、5d)；術(shù)后12周時(shí)，受壓節(jié)段脊髓神經(jīng)元細(xì)胞變性明顯，部分神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)壞死，細(xì)胞核固縮，白質(zhì)出現(xiàn)彌漫性脫髓鞘改變，軸突空泡樣變性更加明顯(見圖5e、5f)。

圖3 球囊注射造影劑后X線表現(xiàn) 圖4 末次注射后CT橫斷面圖像

a 對照組正常神經(jīng)元細(xì)胞 b 對照組正常白質(zhì)和軸突

c 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8周神經(jīng)元細(xì)胞變性、萎縮 d 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8周輕度脫髓鞘和空泡變性

e 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周神經(jīng)元細(xì)胞壞死 f 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周彌漫脫髓鞘和軸突空泡變性

圖5 脊髓慢性壓迫神經(jīng)病理學(xué)改變(HE，×100)

3 討 論

隨著人類對于慢性壓迫性頸脊髓病的認(rèn)識不斷完善，其對于患者及社會往往會造成很嚴(yán)重的后果，因此對于脊髓壓迫的機(jī)制研究也從未停止，而建立理想可靠的動物模型對該疾病的研究尤為重要。1999年，Pinazo等用肝腫瘤細(xì)胞植入的方法模擬脊髓壓迫過程，通過觀察腫瘤細(xì)胞對局部組織的誘導(dǎo)生長，從而造成對脊髓的慢性壓迫[8]。Klironomos等[9]用新西蘭兔進(jìn)行脊髓壓迫實(shí)驗(yàn)，在兔的C7椎板下方植入芳香聚合物，利用芳香聚合物吸水后可以膨脹的特性，在建模后20周，芳香聚合物誘導(dǎo)形成骨贅以及其本身的膨脹結(jié)果，造成對脊髓持續(xù)的慢性壓迫，成功建立了慢性脊髓壓迫動物模型。Hukuda等[10]用犬進(jìn)行脊髓壓迫實(shí)驗(yàn)，首次采用頸前路入路將螺釘擰入實(shí)驗(yàn)動物C4椎體，然后每天將螺釘擰入1個(gè)螺距(約1 mm)，直至實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)脊髓神經(jīng)功能變化，該方法在當(dāng)時(shí)被廣泛應(yīng)用。而Kanchiku等[11]通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，螺釘擰入壓迫脊髓產(chǎn)生的是一種非線性壓力變化，由于脊髓在椎管內(nèi)有一定的空間，在螺釘擰入的早期，對脊髓壓迫有限，實(shí)驗(yàn)動物不會出現(xiàn)脊髓受壓后的神經(jīng)功能變化，而隨著螺釘?shù)倪M(jìn)一步擰入，即使螺釘擰入的深度很小，脊髓也會出現(xiàn)明顯的受壓改變，最終導(dǎo)致受壓脊髓神經(jīng)細(xì)胞的損害。螺釘擰入的方法雖然能模擬脊髓受壓的過程，但是設(shè)計(jì)本身也存在很多的缺陷，比如金屬螺釘本身對于脊髓周圍組織的刺激、手術(shù)后傷口的感染、實(shí)驗(yàn)造成的脊髓壓迫是否是慢性壓迫仍有爭議。而隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)頸部脊髓壓迫過程絕不是簡單的機(jī)械壓迫，除了常見的骨質(zhì)增生、骨贅的形成造成的骨性壓迫外，椎間盤退化突出、后縱韌帶骨化、黃韌帶增生肥厚，甚至是腫瘤的生長都可能對脊髓形成慢性持續(xù)性壓迫。2012年Lee等[12]采用大鼠作為動物模型，用自制的金屬頸椎后路慢性脊髓壓迫裝置植入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)，成功建模，該模型很好的模擬了脊髓壓迫的過程，更重要的是，該動物模型的壓迫過程可以量化，能夠更好的記錄實(shí)驗(yàn)動物的神經(jīng)功能學(xué)表現(xiàn)、病理生理學(xué)表現(xiàn)與量化的壓迫之間的關(guān)系，在臨床轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究中具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選擇山羊?yàn)閯游锬Ｐ?，而非以往采用的犬、兔、鼠等小型動物，主要是因?yàn)樯窖虻念i椎更長，更接近人類的頸椎，其次山羊?yàn)榇笮蛣游?，其對于麻醉及手術(shù)的耐受較小型動物更加強(qiáng)，術(shù)后并發(fā)癥也更少，而本實(shí)驗(yàn)中也確實(shí)未發(fā)生實(shí)驗(yàn)動物因?yàn)槁樽砑笆中g(shù)而發(fā)生意外死亡的情況，再一次證明采用大型動物建模的成功率更加高。

本實(shí)驗(yàn)中慢性脊髓壓迫裝置以醫(yī)用聚乙烯螺釘和導(dǎo)尿管構(gòu)成，并不是金屬螺釘，主要是基于以下幾點(diǎn)考慮：a)聚乙烯材料和導(dǎo)尿管材料相較于金屬材料而言，對于實(shí)驗(yàn)動物的組織刺激更小，組織相容性更加優(yōu)越；b)導(dǎo)尿管頭端的球囊壓迫裝置，質(zhì)地軟，與金屬螺釘直接擰入相比，可以避免與硬膜囊表面的直接接觸而造成損傷；c)采用非金屬材質(zhì)制作壓迫裝置，在術(shù)后進(jìn)行CT檢查時(shí)可以避免金屬材質(zhì)產(chǎn)生的偽影而對實(shí)驗(yàn)影像結(jié)果產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)也由于條件有限，未能對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)一步進(jìn)行磁共振檢查，但非金屬材料裝置的設(shè)計(jì)，除了價(jià)格低廉，也更利于重復(fù)建模，術(shù)后影像學(xué)檢查評估途徑也更加廣泛；d)本實(shí)驗(yàn)中建模后將導(dǎo)尿管固定于體表外，每次只要經(jīng)由尾端注射器向球囊內(nèi)注射造影劑，避免了每次擰入金屬螺釘重復(fù)打開傷口對實(shí)驗(yàn)動物的傷害，也減少了傷口感染的概率。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在建模4周時(shí)，球囊隨著持續(xù)注入造影劑而不斷增大，但所有實(shí)驗(yàn)動物均未出現(xiàn)脊髓神經(jīng)功能障礙，而到了第8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組有三只山羊出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀，不能跳躍，但能跑動(Tarlov 評分均為4分)，到了第12周時(shí)，又有5只山羊出現(xiàn)了不同程度的脊髓神經(jīng)功能障礙，而且Tarlov評分更加低，表明脊髓神經(jīng)損傷更加嚴(yán)重，結(jié)合相同時(shí)間點(diǎn)的影像學(xué)檢查及病理檢查結(jié)果，我們可以看到隨著受壓節(jié)段脊髓受壓程度的加深，受壓節(jié)段脊髓神經(jīng)元細(xì)胞變性逐漸加重，甚至出現(xiàn)壞死，白質(zhì)脫髓鞘改變及軸突空泡樣變性也逐漸加重。我們推測在實(shí)驗(yàn)早期，球囊雖然造成一定壓迫，但是椎管內(nèi)本身存在一定空間，脊髓腹側(cè)受壓后可以適度向背側(cè)移動，只有隨著壓迫進(jìn)一步加重，避讓空間消失后才出現(xiàn)一定的神經(jīng)運(yùn)動功能障礙。這與臨床上的現(xiàn)象相一致：即慢性脊髓型頸椎病早期癥狀輕，可以持續(xù)數(shù)年甚至數(shù)十年無加重，而隨著壓迫程度的不斷累積，當(dāng)?shù)竭_(dá)某一個(gè)臨界點(diǎn)時(shí)，病情可以在短時(shí)間內(nèi)突然加重，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的脊髓運(yùn)動功能障礙。因此我們建議在頸椎病早期癥狀較輕時(shí)就應(yīng)該引起重視，提早干預(yù)，以免壓迫進(jìn)一步加重，造成嚴(yán)重的脊髓損傷。

本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動物建模手術(shù)方法簡單，手術(shù)時(shí)間一般可以控制在30 min左右，手術(shù)創(chuàng)傷??；而且球管固定于體外，可以避免反復(fù)多次切開，降低了傷口感染的風(fēng)險(xiǎn)；脊髓受壓為腹側(cè)壓迫，能很好地模擬臨床中脊髓腹側(cè)慢性受壓的機(jī)制。上述這些優(yōu)點(diǎn)為該建模方法的實(shí)用性、可重復(fù)性提供了基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)研究也存在一些不足之處，比如山羊?yàn)榇笮蛣游铮瑑r(jià)格較高，飼養(yǎng)成本更大，所以本實(shí)驗(yàn)樣本量較??；其次是不同時(shí)間點(diǎn)用球管尾端針筒向球囊內(nèi)注射定量的造影劑，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)針筒內(nèi)推管有部分退出，每次注射的量無法精確控制；第三，本實(shí)驗(yàn)觀察周期為12周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束無一例實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)肢體完全癱瘓，這可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間太短而對實(shí)驗(yàn)動物脊髓壓迫程度不夠有關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)尚需加大樣本量，精確控制每一次注射量，延長觀察時(shí)間，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，對慢性壓迫性脊髓損傷的后續(xù)進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸做更加深入的統(tǒng)計(jì)和分析，更好地實(shí)現(xiàn)該動物模型的科研應(yīng)用價(jià)值。