李 晶， 王友保，王 鑫，郭璐韻

（1.蚌埠醫(yī)學院 生物科學系，安徽 蚌埠233000；2.安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖241000）

長期以來，隨著工農業(yè)的大力發(fā)展，特別是其中金屬的開采與冶煉、農田中化肥施用以及污水灌溉等人類活動導致土壤中重金屬污染情況日趨嚴重，影響到人類的生產生活。重金屬Cu污染是近年來較為嚴重的問題［1-2］，也是研究熱點之一。安徽省銅陵市是重要產銅地區(qū)，銅礦大規(guī)模開采后形成很多尾礦，既占用了大量土地，也對附近環(huán)境造成一定污染。［3-4］土壤酶是土壤中的重要成分，各種生物化學過程以及物質轉化都離不開酶的作用，土壤酶活性與土壤理化性質和肥力密切相關，同時也是土壤生物學性質的體現。［5-6］有報道指出，重金屬污染土壤的土壤酶活性高低與污染程度呈一定負相關［7］，土壤酶活性變化可以作為土壤重金屬污染評價的指標，其中，土壤Cu濃度增加可以顯著抑制土壤磷酸酶活性。

Se是環(huán)境中的微量元素，在人體和動物代謝中具有多種生理功能，并且對重金屬有重要的拮抗作用。［8-9］缺Se能引起大骨節(jié)病、癌癥等多種疾病發(fā)生［10-11］，Se過量會產生毒害作用。施用Se肥對土壤磷酸酶、脲酶和轉化酶活性有激活作用，能減少農作物體內自由基，從而提高作物的抗逆性。［12］由于Se主要通過酶的形式參與生物的生理作用［13］，因此Se和酶關系方面的研究進展備受關注，Se對生物體內酶的影響研究已有大量報道［11，14-15］，而Se與土壤磷酸酶活性關系的研究較少。本研究通過對不同程度Cu污染土壤中加入Se元素的試驗，研究加Se濃度以及時間對Cu污染土壤磷酸酶活性的影響，以期得出改良Cu污染土壤的最適加Se濃度和時間，為銅尾礦區(qū)Cu污染土壤改良與再利用提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 供試土壤

土樣采自安徽省蕪湖市周邊的農田土，采樣時先去除0～5 cm表層后，取5～20 cm土樣，保存?zhèn)溆?。用土壤農化分析方法［16］測定土壤基本理化性質，結果如表1所示。

表1 供試土樣的基本性質

1.2 實驗方案

1.3 測定方法

土壤磷酸酶活性的測定采用比色法測定土壤磷酸酶活性［18］。以1 g土37℃下培養(yǎng)2 h后酚變化的mg數（折算為100 g土中P2O5mg）表示。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 16.0軟件進行數據分析處理。

表2 加Se和Cu培養(yǎng)5 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

2 結果與分析

2.1 不同濃度Se對土壤磷酸酶活性的影響

從表2可得，培養(yǎng)5 d，土壤磷酸酶活性隨土壤Cu含量的增加而減少，不加Se的土壤中，1 600 mg／kg Cu濃度的土壤磷酸酶活性較對照組下降率達到55.3%。這表明加入Cu尤其是高濃度Cu對土壤磷酸酶活性有著顯著抑制作用。而不加Cu的對照組，Se濃度為0.25～1.00 mg／kg時，土壤磷酸酶的活性逐漸增加，Se濃度為1.00 mg／kg時土壤中磷酸酶的活性達到最高，是不加Se組的1.06倍，之后下降。各個Cu處理濃度下，土壤磷酸酶活性均在加Se濃度為1.00 mg／kg達到最大值。由此可見，培養(yǎng)5 d時，Se含量為1.00 mg／kg，對土壤磷酸酶活性有促進作用。Cu濃度升高，Se和Cu的拮抗作用表現就越顯著，與不加Se土壤磷酸酶活性對比中就可以看出，差異逐漸增大。培養(yǎng)5 d土壤磷酸酶活性和Se濃度之間的回歸分析如表3所示，不同Cu濃度下，土壤磷酸酶活性和Se濃度之間呈拋物線關系，Cu濃度為35 mg／kg時，沒有得到合適的回歸曲線。Cu濃度為100 mg／kg時，土壤磷酸酶活性和Se濃度之間呈顯著相關（p＜0.05），Cu濃度為 400、800、1 600 mg／kg 時，呈極顯著相關（p＜0.01）。

由表2和表3可得，隨著土壤Cu濃度提高，土壤磷酸酶的活性明顯受到抑制，培養(yǎng)5 d時，Se的加入能顯著提高磷酸酶的活性，當Cu濃度大于400 mg／kg時，土壤磷酸酶活性與Se濃度呈極顯著相關。

土樣培養(yǎng)到25 d，隨著加入 Cu的濃度升高，土壤磷酸酶活性出現明顯下降（如表4所示）。1 600 mg／kg高Cu濃度時，土壤磷酸酶活性與對照組相比下降48.8%，抑制作用明顯。各個Cu處理組土壤中，Se濃度為0～1.00 mg／kg時，土壤磷酸酶活性隨Se濃度的增加而增大，Se濃度為1.0 mg／kg時達到最大值，顯著高于不加Se土壤，之后各個Cu處理土壤磷酸酶略降低，仍大于不加Se土壤。

表3 土壤磷酸酶活性（y）與Se濃度（x）之間的關系

表4 加Se和Cu培養(yǎng)25 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

25 d時各Cu濃度下土壤磷酸酶活性和Se濃度之間都呈極顯著相關（如表5所示）。各Cu濃度處理中，土壤磷酸酶活性達到最大的Se濃度均在1.21～1.50 mg／kg之間。由表4和表5可得，Se能夠和重金屬Cu產生拮抗，從而降低重金屬Cu對于土壤磷酸酶活性抑制作用，同時單因素Se也能提高土壤磷酸酶活性。

表5 土壤磷酸酶活性（Y）與Se濃度（x）之間的關系

如表6，培養(yǎng)45 d不加Cu對照組在加Se濃度1.00 mg／kg時土壤磷酸酶活性有顯著提高，2.50 mg／kg后又有所下降；各Cu濃度處理土壤中，加Se在一定范圍內能提高土壤酶活性。Se濃度為1.00 mg／kg時，各 Cu 處理土壤磷酸酶活性分別是不加 Se 土壤的 1.13、1.13、1.17、1.22、1.43 和 1.62 倍，差異顯著。 Se 濃度到 2.50 mg／kg 時，土壤磷酸酶活性分別是不加 Se 土壤的 1.00、0.93、1.08、1.16、1.17 和 1.44 倍，普遍高于不加Se土壤磷酸酶活性。因此在Cu污染較為嚴重的土壤中，加一定量的Se元素和Cu能產生拮抗作用，降低重金屬Cu對土壤磷酸酶活性的抑制作用，有利于提高土壤肥力。表7為培養(yǎng)45 d時各Cu濃度處理下，土壤磷酸酶活性和Se濃度之間都呈極顯著相關（p＜0.01）。經回歸方程分析，Cu濃度在35、100、400、800、1 600 mg／kg 時，土壤磷酸酶活性達到最大值的 Se 濃度分別為 1.16、1.45、1.62、1.42、1.48 mg／kg。

表6 加Se和Cu培養(yǎng)45 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

培養(yǎng)到65 d，各Cu濃度處理中，加Se濃度為0～1.00 mg／kg的時候，土壤磷酸酶活性隨Se濃度的增加而增加（如表8 所示），加 Se 濃度為2.00～2.50 mg／kg 時，土壤磷酸酶活性略有降低，2.50 mg／kg Se 濃度下的土壤磷酸酶活性仍然大于不加Se土壤的磷酸酶活性。表9所示，培養(yǎng)65 d時，各Cu濃度下土壤磷酸酶活性和Se濃度之間都呈顯著或極顯著相關性。Cu濃度為35、100、400、800、1 600 mg／kg時，達到最大土壤磷酸酶活性的加 Se 濃度分別為 1.50、1.61、1.52、1.42、1.66 mg／kg。 總體來看，最適加 Se 濃度為1.00～2.00 mg／kg，這與培養(yǎng)45 d時一致。由表8和表9可見，隨著Se濃度的增加，磷酸酶活性提高，但當Se濃度大于1.00 mg／kg時，土壤磷酸酶活性降低，且當Cu濃度大于100 mg／kg時，土壤磷酸酶活性與Se濃度呈極顯著相關。

表7 土壤磷酸酶活性（y）與Se濃度（x）之間的關系

表8 加Se和Cu培養(yǎng)65 d對土壤磷酸酶活性的影響（mg／kg·h）

表9 土壤磷酸酶活性（y）與Se濃度（x）之間的關系

2.2 不同培養(yǎng)時間對土壤磷酸酶活性的影響

通過土樣培養(yǎng)實驗可得，各培養(yǎng)時間段Se對Cu污染土壤磷酸酶活性均具有一定的促進作用，將5 d的時間段作為起始點，分別用25 d、45 d和65 d中土壤磷酸酶活性相對于5 d時增長百分率的平均值，計算土壤磷酸酶活性變化幅度（如圖1所示）。由圖1得，Se濃度在0～2.50 mg／kg范圍時，培養(yǎng)25 d相對于5 d土壤磷酸酶活性增加百分率有所提高，到培養(yǎng)45 d時增加百分率最高，各Se濃度增加率分別為21.80%、23.91%、21.46%、22.29%和21.10%，之后隨著時間增加到 65 d 時，土壤中的磷酸酶活性增加率又有所下降。

圖1 土壤磷酸酶活性增加的百分率

3 討論

目前土壤酶作為一類土壤肥力評價的重要指標，在研究重金屬對土壤影響中有著重要作用。其中土壤磷酸酶，在土壤中能催化磷酸二酯和磷酸單酯水解成為無機態(tài)的磷酸，土壤磷酸酶活性的高低影響土壤中有機磷的轉化和生物有效性。［19］本研究結果表明，重金屬Cu脅迫下，土壤中磷酸酶活性降低，土壤磷酸酶活性和Cu的濃度呈反比。這與馮丹等人［20］發(fā)現Cu顯著抑制土壤磷酸酶活性的研究結果一致。土壤磷酸酶在一定程度上可以作為Cu對土壤污染的程度表征。

Se是人體和動物必需的元素，有研究表明，高濃度的Se對土壤磷酸酶具有顯著的抑制作用［21］，因此可用土壤磷酸酶活性變化作為土壤Se污染參考依據。研究表明，Cu污染土壤中，磷酸酶活性與加入的Se濃度呈顯著相關，加入一定量Se（2.0 mg／kg以內），可以提高土壤磷酸酶活性。Se可以促進酶和底物活化絡合物的速度，增加酶和底物作用的親和力［22］，同時Se和重金屬有著一定的拮抗作用［23］，因而加入Se以后，Cu污染土壤的磷酸酶活性有所增加。

影響土壤酶活性的因素很多，培養(yǎng)土壤過程中，時間效應對于土壤酶活性的影響也不能忽視。在不同時間段土壤酶活性也會有所不同。和文祥等人［24］發(fā)現，將高濃度的As加入土壤中，在最初幾個月中土壤酶活性變化沒有什么規(guī)律，但當As培養(yǎng)到1年時，可以看到對土壤脲酶具有一定的激活作用；楊蘭芳等人［5］研究發(fā)現，一定范圍的Se在短時間內（10 d）可促進土壤蛋白酶活性，而長時間（30 d）加Se卻抑制其活性。所以，研究重金屬污染土壤的酶活性，不僅要研究在某個培養(yǎng)時間上的土壤酶變化情況，還應盡可能研究不同培養(yǎng)時間段土壤酶活性的變化情況。Nowak等人［25］通過對土壤添加不同濃度的H2SeO3，培養(yǎng)112 d以上研究土壤酶活性的變化，發(fā)現高濃度Se抑制土壤磷酸酶活性，而低濃度Se，土壤磷酸酶活性較對照前有所增加。本研究明，在Cu污染土壤中，加入Se的濃度為0～2.50 mg／kg范圍時，培養(yǎng)時間25 d，相對于5 d，土壤磷酸酶活性增加百分率有所提高，培養(yǎng)45 d時增加百分率最高，這與Nowak等人的研究結果低濃度Se增加土壤磷酸酶活性一致。之后隨著培養(yǎng)時間增加到65 d時，土壤中的磷酸酶活性增加率又有所下降。45 d時，Se和Cu拮抗作用最為顯著，Cu對于土壤中磷酸酶活性的抑制作用降到最低點，磷酸酶活性增加幅度達到最大。65 d時，土壤磷酸酶活性降低，但相對于5 d時還是增加的。這可能是由于培養(yǎng)時間較長，Se對Cu的拮抗有所減弱，或者土壤中的微生物含量隨著時間的增加而減少，加上重金屬脅迫，導致磷酸酶活性下降。

有研究發(fā)現在銅陵尾礦區(qū)周圍農田地受到Cu污染，土壤酶活性受到抑制［3，26］。采用一定的土壤改良的方法來治理被Cu嚴重污染的土壤刻不容緩，我國大部分地區(qū)土壤Se含量偏低，屬于缺Se地區(qū)［27］，如果在Cu污染的土壤中適量添加Se元素，既補充Se元素，也降低了Cu污染。

4 結論

（1）不同程度Cu污染的土壤，土壤磷酸酶活性受到抑制，特別是Cu濃度較高時，對土壤磷酸酶活性抑制越明顯。加入Se對于銅污染土壤的磷酸酶活性具有提高作用。

（2）在土壤 Cu 濃度 100～1 600 mg／kg范圍內，添加 Se濃度 1.0～2.0 mg／kg最有利于提高 Cu 污染土壤的磷酸酶活性，加Se對Cu污染土壤中磷酸酶活性的影響顯著。

（3）從加Se的時間看，培養(yǎng)25 d、45 d、65 d時酶活性增幅大于5 d，其中45 d酶活性增幅最大。