1.廣禾堂草本生物科技(上海)有限公司，上海 200030；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

好要湯具有緩解勞累、促進(jìn)產(chǎn)后恢復(fù)的功能，源于婦科臨床補(bǔ)腎強(qiáng)腰方，含覆盆子、黃精、玉竹、酸棗仁等中藥，具有益氣扶正、補(bǔ)肝腎的功效，可緩解體力疲勞，提高人體精力，預(yù)防早衰，促進(jìn)人體各項(xiàng)功能恢復(fù)[1]。研究通過觀察給藥后對(duì)雌性小鼠的陰道角化上皮細(xì)胞、子宮和卵巢的體重及指數(shù)、孕酮P的含量、卵巢和子宮的形態(tài)學(xué)等方面的變化，考察好要湯的促排卵功效，為其科學(xué)合理運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Honour Intrument Shaker歐諾搖床(天津市歐諾儀器儀表有限公司)；Top Pette8-Channer Pipettor移液排槍(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司)；MNT-150美耐特原點(diǎn)數(shù)顯卡尺(上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司)；OLYMPUS CKX41倒置式生物顯微鏡(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司)；ELX800通用酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑 好要湯(批號(hào)：170521，廣禾堂草本科技(上海)有限公司)；定坤丹(批號(hào)：139170102，山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國藥有限公司)；孕酮P試劑盒(上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司)；4%多聚甲醛固定液(批號(hào)：20160314，武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041，廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組及給藥 取雌性小鼠75只，隨機(jī)為5組，空白組，定坤丹組，好要湯低、中、高劑量組，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，根據(jù)體重逐只給藥，連續(xù)給藥15 d?？瞻捉M灌胃生理鹽水，陽性組選用定坤丹，給藥量為臨床等效量(1.62 g/kg)，好要湯高劑量組(6.8 g/kg，臨床等效量的1.5倍)，好要湯中劑量組(4.5 g/kg，臨床等效量)，好要湯低劑量組(3 g/kg，臨床等效量的0.67倍)。

2.2 陰道角化上皮細(xì)胞檢查[1]于給藥第10 d后每日上午9時(shí)，各組小鼠每日陰道涂片1次。將無菌棉簽用生理鹽水浸濕后插入小鼠陰道，充分蘸取分泌物后取出，在玻片上輕輕滾動(dòng)，使分泌物均勻地涂布于玻片上，自然風(fēng)干，以新配制的5%美藍(lán)溶液(95%乙醇溶液配制)染色，2 h后用水漂去多余染色液，待干，置于生物顯微鏡下觀察陰道角化上皮細(xì)胞的情況，連續(xù)涂片1個(gè)動(dòng)情周期(5 d)。以角化上皮細(xì)胞面積大于涂片總面積的50%作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算陽性率[2]。

2.3 血清中孕酮P水平檢測(cè) 末次給藥1 h后，各組小鼠均用摘眼球法取血，將所取血液靜置2 h后，離心(3000 r/min，10 min)，分離血清，按照試劑盒說明書操作。測(cè)定小鼠血清中孕酮P的含量。孕酮P酶聯(lián)免疫分析(ELISA)的具體操作步驟如下：①標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。②加樣：分別設(shè)置空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加帶測(cè)樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不要觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。③加酶：每孔用移液排槍加酶標(biāo)試劑100 μL，除空白空外。④溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。⑤配液：用20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。⑥洗滌：小心揭開封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。⑦顯色：每孔先加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。⑧終止:每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)藍(lán)色)。⑨測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度(OD)值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。⑩計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出直線回歸方程式，根據(jù)樣品的OD值算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度[3-4]。

2.4 子宮、卵巢指數(shù)測(cè)定末次給藥1 h后，摘眼球取血后迅速將小鼠處死，剖開腹腔，取出子宮和兩側(cè)卵巢，剝離周圍組織和脂肪，迅速以電子天平稱量子宮和卵巢的濕重。換算成臟器指數(shù):子宮指數(shù)=子宮重量(mg) /100 g體重，卵巢指數(shù)=卵巢重量(mg) /100 g體重。

2.5 子宮和卵巢組織形態(tài)學(xué)檢查將所取的新鮮子宮和卵巢組織標(biāo)本以4%多聚甲醛固定液固定，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，切片，HE染色。生物學(xué)顯微鏡檢并攝像，觀察組織形態(tài)學(xué)變化，并記錄雙側(cè)卵巢切片中各級(jí)卵泡總數(shù)和黃體數(shù)目。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)陰道上角化細(xì)胞的影響 空白組小鼠在涂片的5 d內(nèi)，動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期的周期性變化比較明顯，可觀察到角化上皮細(xì)胞數(shù)量和白細(xì)胞數(shù)量呈反比的規(guī)律性變化。其余組表現(xiàn)為陰道脫落細(xì)胞性周期延長、不規(guī)則，在采樣時(shí)間內(nèi)可觀察到陰道涂片上出現(xiàn)成片或團(tuán)塊的角化上皮細(xì)胞，只有少量的白細(xì)胞。定坤丹組、好要湯中劑量組和高劑量組均能不同程度地延長雌性小鼠的動(dòng)情期，角化上皮細(xì)胞大于50%的陽性率與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。定坤丹組和好要湯高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 好要湯HYT對(duì)陰道上角化細(xì)胞的影響

注：與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.2 對(duì)血清中孕酮P含量的影響 與空白組比較，好要湯組(3、4.5、6.8 g/kg)能不同程度地升高小鼠血清中孕酮P含量；好要湯高劑量組(6.8 g/kg)與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1、表2。

表2 好要湯HYT對(duì)孕酮P含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.3 對(duì)子宮和卵巢形態(tài)、臟器指數(shù)及各級(jí)卵泡總數(shù)的影響

3.3.1 對(duì)小鼠體重、臟器指數(shù)的影響 好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與空白組比較，體重?zé)o明顯變化，子宮重量有所增加，子宮指數(shù)稍大，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；好要湯高劑量組與空白組比較，卵巢重量明顯增加，卵巢指數(shù)明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與定坤丹組比較，小鼠體重、子宮重量、子宮指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；好要湯中、低劑量組與定坤丹組比較，卵巢重量偏小，卵巢指數(shù)偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；好要湯高劑量組與定坤丹組比，兩者卵巢重量和卵巢指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，即高劑量的好要湯能增大小鼠的卵巢重量和卵巢指數(shù)。見表3。

表3 小鼠體重、子宮和卵巢重量及臟器指數(shù)的比較

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.3.2 對(duì)子宮和卵巢形態(tài)的觀察 由子宮切片(見圖2)和卵巢切片(見圖3)可得，空白組子宮腔內(nèi)膜上皮厚度較薄，腺腔輕度擴(kuò)張，血管較少；卵巢體積稍小，色澤蒼白，卵泡結(jié)構(gòu)不清，或囊泡呈原始狀態(tài)。卵巢皮質(zhì)部可見不同發(fā)育階段的卵泡，可見少量黃體和白體形成，未見囊性卵泡，可見適量脂滴。好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與空白組比較，子宮外觀粗大發(fā)紫，宮腔內(nèi)膜上皮變厚，腺腔擴(kuò)張，可見核下空泡，間質(zhì)疏松；卵巢色澤更鮮艷，卵泡明顯增大，卵泡未見明顯的囊性擴(kuò)張、細(xì)胞變形、壞死炎細(xì)胞浸潤等病變；髓質(zhì)未見充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤。表面見較多黃體，黃體的顆粒細(xì)胞發(fā)育良好，形態(tài)完整，排列整齊緊致[5]。

3.4 對(duì)卵巢中各級(jí)卵泡總數(shù)和黃體數(shù)目的影響 由表4可知，好要湯(3、4.5、6.8 g/kg)組與空白組相比，卵泡總數(shù)有明顯增加的趨勢(shì)，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；好要湯低劑量組、中劑量組與空白比較，黃體數(shù)目無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，高劑量組(6.8 g/kg)與空白組比較，黃體數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各級(jí)卵泡總數(shù)和黃體數(shù)目的比較

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腎虛主要體現(xiàn)在腰膝酸痛、腿軟、耳鳴耳聾、齒發(fā)脫落、失眠多夢(mèng)、潮熱盜汗、性功能減退、女子經(jīng)少、經(jīng)閉或卵巢早衰等方面，其癥狀與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中疲勞或慢性疲勞綜合征的癥狀基本一致，都是人生理機(jī)能衰退的表現(xiàn)[6-7]。因此，緩解體力疲勞、提高精力、養(yǎng)生保健及防止衰老等，都可從補(bǔ)養(yǎng)腎精腎氣入手調(diào)理[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥重視調(diào)動(dòng)人體自身的免疫力，達(dá)到抗疲勞能力，在對(duì)抗疲勞，提高精力，抗衰老方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具有安全有效，毒副作用小的特點(diǎn)。因此，研發(fā)出具有毒副作用小、療效良好、可長期服用的中藥功能食品，將具有較大的市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿Α?/p>

好要湯可延長雌性小鼠的動(dòng)情期，明顯升高角化上皮細(xì)胞陽性率，增大小鼠的卵巢指數(shù)，提高孕酮P含量，明顯增加黃體數(shù)目，闡釋了好要湯方溫補(bǔ)腎陽的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵[8]。