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        熒光染色、PAS染色和美藍(lán)染色在馬拉色菌毛囊炎診斷中的比較

        2018-07-28 07:29:20鐘白玉鄧向芬宋志強(qiáng)翟志芳
        實(shí)用皮膚病學(xué)雜志 2018年3期
        關(guān)鍵詞:毛囊炎色菌載玻片

        鐘白玉,徐 艷,鄧向芬,張 靜,高 星,宋志強(qiáng),翟志芳

        馬拉色菌為馬拉色菌毛囊炎的病原菌,在臨床檢測中一般用KOH涂片直接鏡檢常因圓形均質(zhì)的暗綠色反光顆粒的脂肪滴與馬拉色菌菌體極其相似而混淆,難以獲得滿意效果。本研究對100份馬拉色菌毛囊炎患者臨床標(biāo)本分別采取真菌熒光染色、過碘酸雪夫染色(PAS)和美藍(lán)染色進(jìn)行染色效果及陽性率比較,現(xiàn)報告如下。

        1 材料和方法

        1.1 病例來源

        收集2017年6月~8月皮膚科門診擬診為馬拉色菌毛囊炎患者100例。患者年齡13~45歲,男72例,女28例。病例納入標(biāo)準(zhǔn):擬診為馬拉色菌毛囊炎;皮損多發(fā);無明顯膿皰、糜爛滲出等;同意進(jìn)行該項(xiàng)檢查者。

        1.2 染色液(試劑)

        溯康?真菌熒光染色液(南京漢瑞生物科技有限公司生產(chǎn),重慶林??滇t(yī)療器械有限公司提供,批準(zhǔn)文號:蘇寧械備20160022號);PAS染色試劑:按王端禮主編《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)-實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指南》的配方配制[1];美藍(lán)染色液:按葉順章和張木有主編的《性傳播疾病實(shí)驗(yàn)診斷手冊》的配方配制[2]。

        1.3 取材及染色方法

        主要選擇胸背部和面頸部基本一致的紅色丘疹進(jìn)行取材,取其丘疹內(nèi)容物或皮屑,每例患者取3份標(biāo)本分別用于3種染色。以75%乙醇消毒皮損表面,用拔毛鑷或鈍手術(shù)刀片刮取病變皮屑或擠出有白色膿頭的丘疹內(nèi)容物,分別涂布于3張潔凈的載玻片上備用。分別以熒光顯微鏡或普通光學(xué)顯微鏡在中低倍鏡下尋找視野中的可疑的染色陽性菌體,再以高倍鏡證實(shí)并記錄。

        1.3.1 熒光染色法 在涂布標(biāo)本的載玻片上滴加1滴溯康?真菌熒光染色液,蓋上蓋玻片使染色液與標(biāo)本充分結(jié)合,輕壓蓋玻片并吸去蓋玻片周邊多余染色液,數(shù)秒鐘后于熒光顯微鏡下觀察和記錄。

        1.3.2 PAS染色法 已涂布標(biāo)本載玻片置于95%乙醇中固定1 min,水洗后再將載玻片浸于1%過碘酸溶液中氧化5 min后水洗,把載玻片放于雪夫試劑中染色5 min后水洗,再以偏亞硫酸鈉溶液浸泡1 min后,水洗,自然涼干,滴加1滴香柏油置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

        1.3.3 美藍(lán)染色法 在涂布標(biāo)本的載玻片上滴加1滴美藍(lán)染色液染1~2 min水洗,自然涼干,滴加1滴香柏油置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

        2 結(jié)果

        經(jīng)真菌熒光染色后,可見圓形或葫蘆形的酵母孢子呈亮綠色熒光,背景反差較大,圖像清晰,皮屑呈淺藍(lán)色,而其他成分(如脂滴、氣泡)不著色;②經(jīng)PAS染色后,高倍鏡下可見孢子染成深玫瑰紅色,較為清晰,角質(zhì)細(xì)胞呈淡紅色;③經(jīng)美藍(lán)染色后,可見圓形、出芽成葫蘆形的紫紅色酵母孢子,較為清晰,脂滴、氣泡等背景中的雜質(zhì)不著色,皮屑亦染成深藍(lán)色(圖1)。3種染色方法的陽性率比較見表1。

        表1 3種染色方法在馬拉色菌毛囊炎診斷中的陽性率比較 [例數(shù)(%)]

        3 討論

        圖1 不同染色方法檢測馬拉色菌鏡下所見

        馬拉色菌為健康人皮膚正常寄生菌群之一,但與馬拉色菌毛囊炎、頭皮屑過多、脂溢性皮炎、銀屑病、痤瘡等有關(guān)。臨床中,常規(guī)KOH涂片檢測方法對于馬拉色菌的檢測敏感度并不能很好滿足臨床要求。筆者對目前應(yīng)用于臨床的真菌熒光染色、PAS染色及美藍(lán)染色3種檢測方法進(jìn)行了比較分析,三者各有其優(yōu)缺點(diǎn)。首先,真菌熒光染色液可用于人體組織或樣本的染色處理,包括皮屑、甲屑、毛發(fā)、尿液、體液及陰道分泌物等,在熒光顯微鏡下定性檢測真菌。主要原理是熒光增白劑與組織中可能存在的真菌細(xì)胞壁β-多糖結(jié)合,如幾丁質(zhì)和纖維素等,在紫外光的激活下,可使真菌顯示出熒光。通過250~400 nm濾鏡的熒光顯微鏡下觀察,判斷真菌的存在,即使僅有少量的菌體,也能迅速捕獲,大大節(jié)省了檢測時間,并提高了陽性率。PAS染色為傳統(tǒng)的多糖成分染色法,是利用過碘酸作為氧化劑,將多糖的葡萄糖分子的兩個相鄰帶有羥基的-C-C-鍵打開,生成醛基再與染色劑結(jié)合。雪夫試劑中的堿性品紅為一種混合物,經(jīng)過亞硫酸和二氧化硫的作用,醌式結(jié)構(gòu)的雙鍵被破壞而消失形成無色復(fù)紅,再經(jīng)氧化后醛基與無色復(fù)紅液進(jìn)行結(jié)合呈紫紅色,菌體染色成紫紅而清晰可見。美藍(lán)作為一種細(xì)胞染色劑,其染色方法是利用美藍(lán)染料對組織蛋白、菌體(多糖成分)有異染性,在配制時若加微量10% KOH溶液即成堿性美藍(lán)染色液,染色過程中使皮屑標(biāo)本充分溶解,以便菌體與染色液較好結(jié)合,菌體染色呈深藍(lán)色,而背景僅著淡藍(lán)色,增加了對比度,提高了分辨力。

        經(jīng)比較研究表明,3種染色方法對馬拉色菌均具有很高的陽性檢出率,且其檢測陽性率相接近。但三者相比較,真菌熒光染色法簡便快捷,僅需1滴染色液立即壓片即可熒光顯微鏡觀察,而且鏡下背景反差較大,圖像清晰,相比于PAS和美藍(lán)染色法更易于觀察,省時省力。但真菌熒光染色法成本相對較高,需要在熒光顯微鏡下觀察,限制了其臨床的廣泛使用。PAS染色法菌體被染成玫瑰紅色,結(jié)締組織染成淺紅色,菌體較易于識別,但其操作相對繁鎖、費(fèi)時,且陽性率略低于另外兩種方法。相對于前二者而言,美藍(lán)染色法的菌體染成紫紅色,易與脂滴、細(xì)胞間隙相鑒別,而且該方法操作簡便,對于初學(xué)者易于常握,適用于臨床廣泛應(yīng)用。

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