李 龍，劉鎖珠，王宏輝，董 瀅

(1.楊凌職業(yè)技術學院 動物工程分院，陜西 楊凌 712100；2.西藏農(nóng)牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000)

益生菌被定義為“當攝入充足數(shù)量時對動物健康發(fā)揮有益的活的微生物的總稱”[1]。益生菌作為一種綠色、安全的微生態(tài)制劑已廣泛地用于動物生產(chǎn)中，國內(nèi)外有關其應用效果的報道也很多。大量研究表明日糧添加益生菌能夠改善肉雞生產(chǎn)性能[2]，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率[3]，抑制腸道致病菌生長[4]，調(diào)節(jié)機體免疫功能[5]。但目前關于益生菌對高海拔缺氧環(huán)境下肉雞生產(chǎn)性能的影響還未見報道，因此本試驗旨在研究益生菌對高原缺氧條件下肉雞生產(chǎn)性能、腸道消化酶活性和腸道形態(tài)的影響，為后期益生菌在高原肉雞生產(chǎn)中的研究和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌菌粉的制備

試驗中所用的益生菌(LactobacillusplantarumJM113)菌株是從健康藏雞腸道中分離獲得，該菌株具有較好的耐酸耐膽鹽特性、粘附特性和抑菌效果。益生菌菌粉制備過程參照文獻[6]提供的方法進行。

1.2 試驗動物及試驗設計

1.2.1 試驗動物 270只1日齡健康AA肉仔雞隨機分為3組，每組6個重復，每個重復15只雞，試驗期42 d。試驗期內(nèi)肉雞飼喂全價商品日糧，1～21日齡飼喂前期日糧，22～42日齡飼喂后期日糧。3個處理組分別為：(1)對照組飼喂基礎日糧；(2)抗生素組在基礎日糧中添加金霉素(添加劑量為50 mg/kg)；(3)益生菌組在基礎日糧中添加Lactobacillus plantarum JM113菌粉(添加劑量為109CFU/kg)。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 本試驗在西藏林芝地區(qū)西藏農(nóng)牧學院教學實習基地(海拔 2986 m)進行，所有試驗雞飼養(yǎng)在 3 層金屬雞籠內(nèi)，每個處理 6個雞籠，每個雞籠 15只雞，前期(1～21 d)飼養(yǎng)密度為 15 只/m3，后期飼養(yǎng)密度為 7.5 只/m3，試驗期內(nèi)雞自由采食和飲水。第 1 周雞舍溫度為 30～33 ℃，之后逐漸降低，3周后溫度保持在 23～25 ℃。 每天23 h 照明， 1 h熄燈。消毒和免疫程序按常規(guī)程序進行。

1.3 生產(chǎn)性能測定

在試驗期1 d，21 d和42 d分別稱量每個重復雞只的總重量和總采食量，并計算平均日采食量ADFI和飼料轉(zhuǎn)化率FCR。

1.4 樣品采集和測定

1.4.1 腸道形態(tài) 在21和42日齡每個重復隨機選取2只雞，頸靜脈放血處死后解剖，剪取十二指腸端部，放入裝有4%福爾馬林的棕色瓶中固定，收取剩余十二指腸中的內(nèi)容物，迅速放于-20 ℃冰箱保存。固定的十二指腸利用冰凍切片機制備厚度成6 μm的冰凍切片，HE染色，電子顯微鏡下(40倍)測定腸絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)，每個樣品選擇10個不同典型視野，每個視野絨毛高度和隱窩深度分別測定10個數(shù)值。腸道內(nèi)容物在測定前用生理鹽水進行10倍稀釋并勻漿，離心，保留上清液。通過試劑盒測定上清液中的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性(南京建成生物工程研究所)，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4.2 微生物群落分析 無菌采集肉雞盲腸內(nèi)容物，利用糞便DNA提取試劑盒(OMEGA)提取肉雞盲腸內(nèi)容物菌群總基因組DNA，采用特異性引物對肉雞盲腸中總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌進行PCR擴增，引物序列見表1。將含有特定菌群16S rRNA基因的質(zhì)粒從 1×103～1×109(copies / mL)逐級稀釋構(gòu)建標準曲線，熒光定量采用采用25 μL反應體系，其中SYBR Premix (Takara) 12.5 μL，上下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，滅菌水9.5 μL，模板2 μL。每個樣品做三個重復。乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的含量以菌群/總菌來表示。

1.5 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件的one-way ANOVA進行單因素方差分析，Dancan法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，結(jié)果用平均值±標準差表示。

表1 特定菌群熒光定量引物[7-8]Table 1 Fluorescent quantitative primer for specific bacteria flora

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對高原缺氧條件下肉雞生產(chǎn)性能的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加益生菌或抗生素對肉雞生長前期(0～21日齡)的BW、ADFI和FCR均無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，益生菌顯著提高了生長后期的BW(P<0.05)，且與抗生素組差異不顯著(P>0.05)。益生菌組和抗生素組肉雞生長后期的FCR均顯著低于對照組(P<0.05)。生長后期各組之間FCR差異不顯著(P>0.05)(見表2)。

表2 益生菌對高原缺氧條件下肉雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effect of probiotics on growth performance of broiler reared at hypoxic environment

注：同行數(shù)據(jù)肩標字母不相同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同。
Note: Values with different superscripts in the same row mean significant difference (P<0.05), the same superscripts insignificant difference (P>0.05).The same below.

2.2 益生菌對肉雞腸道消化酶活性的影響

益生菌對高原缺氧條件下肉雞腸道消化酶活性的影響見表3。與對照組相比，日糧中添加益生菌可以顯著提高21 d肉雞腸道淀粉酶活性(P<0.05)，但是對胰蛋白酶和脂肪酶活性無顯著影響(P>0.05)。42日齡肉雞腸道中淀粉酶活和脂肪酶活性均顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05),但對照組與抗生素組在3種消化酶活性上均無顯著差異(P>0.05)。

表3 益生菌對高原缺氧條件下肉雞腸道消化酶活性的影響Table 3 Effect of probiotics on digestive enzyme activity of broiler reared at hypoxic environment IU/mL

2.3 益生菌對肉雞十二指腸形態(tài)的影響

益生菌對高原缺氧條件下肉雞十二指腸形態(tài)的影響見表4。相比于對照組和抗生素組，益生菌處理組顯著提高了21 d和42 d肉雞絨毛長度和V/C比值(P<0.05)。與對照組相比，抗生素處理組在絨毛高度、隱窩深度和V/C比值上均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 益生菌對肉雞盲腸微生物群落的影響

由表5可見，相比于對照組，抗生素處理組顯著降低了肉雞盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌含量(P<0.05)，益生菌處理組顯著提高了乳酸桿菌含量(P<0.05)，并顯著降低了大腸桿菌和沙門氏菌含量(P<0.05)。益生菌處理組肉雞盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌含量顯著高于抗生素處理組(P<0.05)。

表4 益生菌對高原缺氧條件下肉雞十二指腸腸道形態(tài)的影響Table 4 Effect of probiotics on intestine structure of broiler reared at hypoxic environment μm

表5 益生菌對高原缺氧條件下肉雞盲腸菌群組成的影響Table 5 Effect of probiotics on microbiota composition of broiler reared at hypoxic environment

3 討 論

在本研究中，益生菌對肉雞生長前期(0～21日齡)的生產(chǎn)性能沒有顯著影響。在生長后期(22～42日齡)，抗生素和益生菌均顯著地改善了FCR，提高了肉雞42日齡體重，且益生菌與金霉素具有相似的效果。Peng 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加益生菌顯著提高了生長后期的平均日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率。而Shokryazdan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加益生菌顯著提高肉雞42日齡體重和生長后期的飼料轉(zhuǎn)化率。不同的益生菌飼養(yǎng)試驗測定的生產(chǎn)性能存在差異，這可能是不同試驗使用的菌株、計量、飼喂方式等存在差異造成的。本試驗中益生菌提高肉雞42日齡體重和降低飼料轉(zhuǎn)化率可能與腸道淀粉酶活性和脂肪酶活性的增加、改善腸道形態(tài)有關。消化酶對營養(yǎng)物質(zhì)的消化是動物吸收營養(yǎng)的第一步，其活性高低直接影響動物對日糧的利用效果，進而影響動物的生產(chǎn)性能。腸道中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性的高低直接反應了機體對淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)消化能力[11]。生長后期是肉雞脂肪沉積的主要階段，同時肉雞對能量的需要量也大幅增加，因此脂肪酶活性和淀粉酶活性的高低直接關系到脂肪沉積量。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以顯著提高42日齡的十二指腸淀粉酶活和脂肪酶，而抗生素對消化酶的酶活沒有顯著影響。Li 等[12]發(fā)現(xiàn)，益生菌可以顯著增加肉雞腸道中的脂肪酶活性。Sun 等[13]和Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，給肉雞飼喂含有益生菌的日糧后腸道中的脂肪酶和蛋白酶活性顯著提高，但益生菌對淀粉酶活性無影響。不同的益生菌菌株產(chǎn)酶活性存在差異，這可能是各研究結(jié)果不盡相同的主要原因。

益生菌促生長的另一個主要原因是改善動物機體的腸道形態(tài)，其中小腸是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位。小腸的吸收能力與腸絨毛高度和隱窩深度有密切關系。腸絨毛越長，表面積越大，越有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而隱窩深度反應腸細胞的生成速度，研究中常以V/C作為腸絨毛吸收能力的綜合指標。本研究發(fā)現(xiàn)，在21 d和42 d，添加益生菌均能顯著提高肉雞的腸絨毛高度和V/C。Shokryazdan等[10]研究表明，日糧添加益生菌可以顯著提高V/C。 Wang等[14]研究表明，益生菌可以顯著提高肉雞絨毛高度和V/C。而益生菌改善腸道結(jié)構(gòu)的原因目前發(fā)現(xiàn)有三種：(1)益生菌的中間代謝產(chǎn)物或特殊酶系能夠促進腸上皮細胞生長[15]；(2)抑制病原菌從而保護腸上皮細胞免受病原菌的損傷[16]，在本試驗中同樣發(fā)現(xiàn)益生菌能夠增加腸道有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌含量，降低有害菌大腸桿菌和沙門氏菌含量；(3)益生菌會產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(特別是丁酸)促進腸上皮細胞分裂[17]。雖然本試驗發(fā)現(xiàn)益生菌能夠提高肉雞腸絨毛高度和V/C比值，但其機理還有待進一步研究。

此外，益生菌還可能通過別的途徑提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而改善生產(chǎn)性能。益生菌提高生產(chǎn)性能可能有以下原因：(1) 某些益生菌可以分泌一些胞外消化酶包括淀粉酶，從而補充腸道消化酶，提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率[18]；(2) 益生菌可能會刺激腸道細胞分泌更多的內(nèi)源酶，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化；(3) 益生菌在肉雞體內(nèi)能夠黏附著在淀粉顆粒上，促進淀粉的消化；(4) 益生菌產(chǎn)生有機酸，一般消化酶的最適pH為偏酸性，而有機酸的產(chǎn)生可加強腸道的蠕動和胃液分泌，進而促進消化吸收，增強消化酶活性[19]。本研究中雖然金霉素也可以提高肉雞的生產(chǎn)性能，但是對金霉素對消化酶活和腸道形態(tài)均沒有顯著影響。金霉素提高肉雞生產(chǎn)性能主要是通過減少腸道微生物或改變腸壁厚度實現(xiàn)的?？紤]到抗生素濫用會對動物和環(huán)境帶來一系列負面影響，而益生菌具有安全無污染的特性，因此益生菌可以作為高海拔地區(qū)肉雞飼料添加劑。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，益生菌可以提高高海拔缺氧條件下肉雞消化道中消化酶活性，改善腸道形態(tài)，從而提高生產(chǎn)性能，因此益生菌可能作為高海拔缺氧條件下肉雞日糧的一種添加劑。