（云南省臨滄市農(nóng)業(yè)學(xué)校，云南臨滄 677000）

急性心肌梗死（AMI）是世界范圍內(nèi)有著有著較高致殘甚至致死率的疾病類型?，F(xiàn)階段，在臨床中，多采用手術(shù)、介入、藥物等方式治療AMI，但無論采用何種方式，其治療目的無外乎是抑制心律失常，改善心肌缺氧、缺血，使心臟灌注始終處于良好狀態(tài)[1]。雖然有著比較多的治療方案，但其中的大部分治療方法，均難以實(shí)現(xiàn)對(duì)梗死的心肌等進(jìn)行有效修復(fù)。針對(duì)由AMI所引起的自發(fā)性血管新生反應(yīng)而言，其實(shí)為一個(gè)比較典型的帶有慢性、保護(hù)性特點(diǎn)的反應(yīng)過程，僅能對(duì)阻塞冠脈下的心肌進(jìn)行部分補(bǔ)充，而難以達(dá)到完全修復(fù)[2]。針對(duì)人參等中藥材而言，其經(jīng)常被用作心腦血管疾病、糖尿病、肝肺纖維化等的預(yù)防與治療。人參當(dāng)中含有豐富的黃酮、糖、皂苷等，而主要活性成分為皂苷。人參總皂苷（TG）包含40多種皂苷單體（Rb1、Rg1等），其中，Rb1等對(duì)心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用，還能使內(nèi)皮細(xì)胞大量釋放一氧化氮[3]。本文針對(duì)TG對(duì)心肌梗死后血管新生心室重構(gòu)以及對(duì)心功能的影響作一探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

♂（Sprague-Dawley，SD）大鼠，月齡區(qū)間為2～3個(gè)月，體重210～240g；選用由北京天然藥物研究院所提供的TG，其主要從人參的葉、莖所提取，其中，含人參皂苷Rb15.25%，、Rd13.64%，Re21.59%，Rg15.19%，除此之外，其中還含有其他類型的人參皂類化合物。利用無菌生理鹽水配制儲(chǔ)存液：2、4gL-1，然后置于4℃環(huán)境中保存。選用購自大連寶生物公司的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、VEGF以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；CD31單克隆抗體（Santa Cruz公司）；選用購自美國ABI公司的SYBR GREEN PCR Mas-ter Mix。

1.2 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI）與2400PCR擴(kuò)增儀（美國BIO-RAD）；Sequoia 512彩色多普勒超聲診斷儀（德國SIEMENS）；Ken2 Cardico302心電圖機(jī)（北京明成森木醫(yī)療公司產(chǎn)）；ALC-V8S小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技公司）。

1.3 心臟彩色超聲多普勒檢查及篩選

取適量水合氯醛，注射于腹腔，完成麻醉后，將大鼠擺成仰臥位，且加以固定，用硫化鈉（1.25mol·L-1）對(duì)左胸前進(jìn)行退毛處理。用彩色多普勒超聲診斷儀（探頭頻率設(shè)定為15MHz）對(duì)超聲心動(dòng)圖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分別取左室長(zhǎng)軸切面與左室乳頭肌短軸切面，放大圖像，然后以M型取左室后壁，然后用同樣型狀取左室前壁。選取比較清晰的圖像進(jìn)行錄像，并儲(chǔ)存，對(duì)所得錄像進(jìn)行系統(tǒng)化分析測(cè)量：左室短軸縮短率（FS）、左室射血分?jǐn)?shù)（EF）、收縮末期左室容積（LVESV）、舒展末期左室容積（LVEDV）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）。

1.4 AMI模型制備與分組

根據(jù)相關(guān)報(bào)道[4]構(gòu)建AMI模型。氣管插管后，與小動(dòng)物呼吸機(jī)相連接，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下緣之間，即距離主動(dòng)脈根部大約為2～3mm位置處，對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支實(shí)施結(jié)扎處理，如果心肌顏色變成暗紅色，或者是出現(xiàn)心電圖示ST段抬高，則可明確為模型制作成功（Fig1）；假手術(shù)組（sham組）共計(jì)8只，僅開胸，不進(jìn)行結(jié)扎處理。將建模型成功的大鼠進(jìn)行分組（3組），TG高劑量組（TG-H組），共計(jì)10只，在胸腔處注射TG40mg·kg-1·d-1；TG低劑量組（TG-L組），共計(jì)10只，相同部位注射20mg·kg-1·d-1；模型組（model組），共計(jì)12只。model組、sham組均實(shí)施生理鹽水腹腔注射，完成手術(shù)后1d，用藥，持續(xù)用藥35d。

1.5 心臟組織病理學(xué)檢查

將大鼠處死，開胸，并將心臟取出，沿著冠狀溝，將心房剪去，于結(jié)扎點(diǎn)下方位置，沿著冠狀面，把左心室予以橫切，使之成為兩部分，以肉眼方式對(duì)腔徑進(jìn)行觀察，同時(shí)觀察心室壁變化，取心尖組織，采用多聚甲醛加以規(guī)定，然后實(shí)施脫水、石蠟包埋以及切片HE染色等處理，在顯微鏡下，對(duì)心肌組織的病理學(xué)變化進(jìn)行觀察；進(jìn)行Masson染色，對(duì)藍(lán)染的膠原纖維分布情況進(jìn)行細(xì)致觀察，然后對(duì)心肌纖維化程度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.6 Real-timePCR檢測(cè)基因表達(dá)

依據(jù)對(duì)應(yīng)的試劑盒說明書，用TRIzol對(duì)心肌組織總RNA進(jìn)行提取，運(yùn)用專用型紫外分光光度計(jì)，對(duì)A260與A280比值進(jìn)行測(cè)定，即1.8～2.0區(qū)間內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄，稀釋處理，加入到cDNA中（7mgL-1），然后再將其加入到SYBR GREEN PCR Mas-ter Mix當(dāng)中，開展定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為：72℃，1min，4℃；60℃，20s；95℃，5min；40個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TG對(duì)AMI大鼠心功能的影響分析

相比于sham，model組LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有顯著增加（P＜0.05），而FS、EF則有顯著減?。≒＜0.05），有比較明顯的左心室收縮情況，此外，舒張功能存在障礙。采用TG進(jìn)行持續(xù)35d的干預(yù)后，相比于model組，TG-H組LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有顯著減?。≒＜0.05），能夠準(zhǔn)確反應(yīng)左心室收縮功能的FS、EF，相比模型組，均有顯著增高（P＜0.05）；相比于model組，TG-L組的FS、EF有顯著增大（P＜0.05）。見表1。

表1 TG對(duì)AMl術(shù)后第35d大鼠心功能的影響

2.2 TG對(duì)AMI大鼠左心室組織病理學(xué)的影響

HE染色之后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，從中得知，sham組有著比較整齊的心肌纖維排列，不存在破壞情況，且有著均勻、豐富的胞質(zhì)，有著正常的細(xì)胞間隙；而對(duì)于model組，其在具體的心肌組織缺血梗死區(qū)心室壁方面，則明顯變薄，心肌纖維已經(jīng)消失，且形成瘢痕；TG-H組、TG-L組相比于model組，在心室壁方面有顯著增厚，且保存著較多的心肌纖維，能觀察到諸多呈島狀的心肌組織，瘢痕面積較小。

2.3 TG對(duì)左心室心肌組織bFGFmR-NA、VEGF表達(dá)的影響

根據(jù)左心室心肌組織real-time PCR最終結(jié)果得知，model組相比于sham組，左心室心肌組織bFGF-mRNA、VEGF表達(dá)水平比較，差異不明顯；相比于model組與sham組，TG-H組與TG-L組能夠顯著提升bFGF mRNA、VEGF的表達(dá)水平（P＜0.05）。

3 討論

冠狀動(dòng)脈結(jié)扎會(huì)造成心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的缺血壞死，由于心肌細(xì)胞存在著比較有限的再生能力，且致死區(qū)域大部分被纖維組織替代，出現(xiàn)心室重構(gòu)情況，因而會(huì)對(duì)心臟功能造成較大程度影響。所以，增加組織血液供應(yīng)以及血管新生，乃是治療AMI的核心所在[5]。由本次研究得知，TG持續(xù)用藥35d后，對(duì)大鼠AMI起到了較好的保護(hù)作用，另外，在心室重構(gòu)以及心功能方面，也得到了有效改善；AMI后，大鼠FS、EF得到顯著提升，特別是高劑量組，LVESV、LVEDV、LVDs及LVDd均有顯著減小，表明采用TG治療后，AMI大鼠心臟舒縮功80FD相比于模型組，有顯著提高。經(jīng)組織病理學(xué)測(cè)定得知，TG組在具體的心肌梗死面積方面，相比未用藥前，得到顯著縮小，梗死區(qū)心肌纖維化程度比較輕，且存在著諸多心肌細(xì)胞，有著比較厚的心室壁，由此得知，TG對(duì)于AMI大鼠心室重構(gòu)，具有顯著的抑制作用，這也表明TG對(duì)于心功能有較好的抑制作用。

微血管密度能夠準(zhǔn)確折射出側(cè)支循環(huán)的最可靠指標(biāo)，而梗死范圍的大小則能反映出側(cè)支循環(huán)的當(dāng)前情況，且梗死面積與側(cè)支循環(huán)之間存在顯著負(fù)相關(guān)，即梗死面積越小，則側(cè)支循環(huán)便越豐富[6]。由免疫組染色結(jié)果得知，TG組大鼠梗死去的MVD顯著增加，由此得知，TG刺激AMI大鼠，使其血管新生，對(duì)構(gòu)建側(cè)支循環(huán)有重要促進(jìn)作用。而由Masson染色與HE染色結(jié)果也能得知，在采用TG治療后，小鼠心肌梗死區(qū)域大幅減少，而且膠原纖維也明顯減少，有著較多的存活狀態(tài)的心肌組織。由此表明，TG不僅對(duì)AMI后梗死區(qū)新生具有促進(jìn)作用，而且對(duì)其周邊血管新生，同樣具有重要的促進(jìn)作用，可以增加缺血區(qū)血液供應(yīng)，大幅改善AMI之后的心室重構(gòu)。bFGF與VEGF實(shí)為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化與生長(zhǎng)的核心要素，在整個(gè)血管新生中，其發(fā)揮著舉足輕重的作用。當(dāng)出現(xiàn)缺血損傷時(shí)，會(huì)一定程度上調(diào)bFGF、VEGF的表達(dá)，造成內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)典型的有絲分裂因子活化，此情況對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)增長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，還能一定程度誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其不斷分化與成熟，而對(duì)于bFGF來講，其可以對(duì)整合素的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，因而能夠大幅提升內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力以及黏附能力，最終生成新的血管。有報(bào)道已證實(shí)，bFGF與VEGF表達(dá)上調(diào)，可以促使局部組織在灌注與代謝方面的增加，減輕缺血損傷，最終達(dá)到改善心功能的目的。由本次研究得知，TG組大鼠梗死區(qū)心肌組織bFGF mRNA、VEGF的表達(dá)，存在顯著增高，特別是高劑量組，更為顯著，由此表明，TG能夠上調(diào)AMI大鼠心肌組織當(dāng)中的bFGF mRNA與VEGF表達(dá)，對(duì)缺血區(qū)血液供應(yīng)有改善作用。

VEGF實(shí)為一種典型的促血管生成因子，當(dāng)小鼠心肌缺血發(fā)生1d時(shí)，在梗死區(qū)表達(dá)便出現(xiàn)明顯升高，誘導(dǎo)出現(xiàn)帶有自發(fā)性質(zhì)的血管新生，但是，當(dāng)梗死持續(xù)14d時(shí)，其下降至梗死前的水平。由本實(shí)驗(yàn)可知，心肌梗死35d時(shí)，模型組VEGF水平相比sham組，差異不明顯，但TG組VEGF水平卻有顯著升高。由此可知，TG處理對(duì)VEGF有刺激作用，能使其持續(xù)高表達(dá)，以此對(duì)AMI激發(fā)的自發(fā)性血管新生不足予以補(bǔ)充。

綜上所述，TG對(duì)改善急性心肌梗死大鼠心室重構(gòu)及梗死區(qū)心肌血液供應(yīng)以及心臟功能恢復(fù)，有顯著促進(jìn)作用，其作用機(jī)制與上調(diào)心肌組織bFGF、VEGF基因表達(dá)相關(guān)。