劉海琴

（鶴壁市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南鶴壁 458000）

1 方法原理

畜禽肉（雞肉）中殘留的氟喹諾酮類(lèi)藥物（環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星）用磷酸鹽緩沖液提取，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，流動(dòng)相洗脫后。用液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。

2 儀器與試劑

安捷倫1100液相色譜儀-配熒光檢測(cè)器，

分析天平 感量0.00001g.

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，

VX-2渦旋振蕩器，

Eppendorf移液器（成套），3～30k高速冷凍離心機(jī)，固相萃取裝置， HLB固相萃取柱.

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 試劑的配制

（1）磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并稀釋500ml，用5.0mcl/ml氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)（pH=7.0）

（2）磷酸/三乙胺溶液（0.05mcl/l）取85%磷酸3.4 ml，用水稀釋至1000ml，用三乙胺調(diào)節(jié)pH=2.4.

3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

（1）分別稱(chēng)取鹽酸環(huán)丙沙星、甲磺酸達(dá)氟沙星、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星對(duì)照品各約25mg，精密稱(chēng)定，分別于25ml棕色容量瓶中，用0.03mcl/l氫氧化鈉溶液稀釋成濃度分別為1mg/ml的儲(chǔ)備液。（達(dá)氟沙星儲(chǔ)備液濃度配制成0.2mg/ml）

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 分別量取1mg/ml（0.2mg/ml）的儲(chǔ)備液各0.1ml于50ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋成濃度為2μg/ml（0.4ug/ml）的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

3.3 方法步驟

3.3.1 質(zhì)量控制樣品的制備

（1）空白樣品：取空白試樣，與待測(cè)樣品同步處理。

（2）添加樣品：取空白樣品，添加2μg/ml（0.4μg/ml）的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1ml，制的濃度為100μg/kg的陽(yáng)性添加試料，與待測(cè)樣品同步處理。

3.3.2 提取

（1）取勻漿的試料2±0.02g，置50ml離心管中，加磷酸鹽緩沖液10.0ml，渦旋混合，中速震蕩5min，14000r/min離心10min，傾取上清液。（磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并稀釋500ml，用5.0mcl/ml氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=7.0）

（2）用磷酸鹽緩沖液10.0ml重復(fù)提取一次。合并兩次上清液，備用。

3.3.3 凈化

（1）固相萃取柱依次用甲醇2ml，磷酸鹽緩沖液2ml預(yù)洗。

（2）取上述備用液體5.0ml過(guò)柱。

（3）用水2ml洗柱，擠干。

（4）用流動(dòng)相2.0ml洗脫，收集，擠干，渦旋混合。過(guò)0.22μm微孔濾膜，供上機(jī)測(cè)定。

3.3.4 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度為5、

10、20、50 、100、200、500ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按表1配制。

表1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

3.4 儀器色譜條件

色譜柱：C18（4.6×150mm 5μm）；

柱溫：30℃；

流動(dòng)相：0.05mcl/l磷酸溶液/三乙胺-乙腈（87+13）；

流速：1.0ml/min；

進(jìn)樣量：20μl；

檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280nm；發(fā)射波長(zhǎng)450nm。

20ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液中氟喹諾酮類(lèi)藥物色譜圖

100μg/kg空白雞肉添加試樣中氟喹諾酮類(lèi)藥物色譜圖

3.5 結(jié)果分析

3.5.1 線(xiàn)性范圍

取濃度為5～500ng/ml 氟喹諾酮類(lèi)藥物系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。結(jié)果表明（見(jiàn)表1），在5～500ng/ml系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度范圍內(nèi)，喹諾酮類(lèi)藥物峰面積與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 喹諾酮類(lèi)藥物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)

3.5.2 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定

稱(chēng)取同一來(lái)源的空白雞肉樣品3份，每份2.0g，分別添加2μg/ml（0.4μg/ml）的喹諾酮類(lèi)藥物溶液0.1ml，制備濃度為100μg/kg（達(dá)氟沙星20μg/kg）的陽(yáng)性樣品，按本方法測(cè)定，計(jì)算回收率在73.1%～84.54%，標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.84%～5.4%，表明本方法重復(fù)性較好，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 喹諾酮類(lèi)藥物的回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，雞肉樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后，經(jīng)固相萃取柱凈化后，采用液相-熒光檢測(cè)器法測(cè)定，外標(biāo)法定量，回收率為73.1%～84.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～5.4%（n=3）.本方法系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度范圍內(nèi)，喹諾酮類(lèi)藥物峰面積與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，準(zhǔn)確度好、近年以來(lái)經(jīng)過(guò)對(duì)各類(lèi)動(dòng)物組織檢測(cè)的結(jié)果表明，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可滿(mǎn)足市級(jí)檢測(cè)單位對(duì)動(dòng)物組織中4種喹諾酮類(lèi)藥物殘留日常檢測(cè)需要。