史鋒厚，趙 瑞，羅 帥，沈永寶

（南京林業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

扦插作為林木無性繁殖的重要方式，已被廣泛應(yīng)用于林木種苗生產(chǎn)。影響插穗生根的因素較多，既包括樹種的遺傳因素和插穗的生理狀態(tài)，又包括扦插環(huán)境。一般插穗的不定根原始體按其形成時間分為潛伏根原始體和誘生根原始體兩種[1]。林木扦插生根難易和生根時間因樹種（品種）而異，源于枝條內(nèi)是否存在潛伏根原始體和根原基誘導(dǎo)的難易，一般而言，存在潛伏根原始體的樹木扦插較易生根[2]，誘導(dǎo)根原基發(fā)生部位較多的樹種較易生根[1]。植物激素或生長調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)插穗生根，尤其對于一些難生根樹種效果明顯，它不僅可以提高生根率、縮短生根時間，還可以提高生根質(zhì)量，如經(jīng)600 mg/L NAA溶液處理的繡球插穗生根率可達(dá)94%[3]，外施6 000 mg/L K-IBA可顯著提高北美香柏插穗的生根率及生根質(zhì)量[4]，經(jīng)500 mg/L IBA溶液浸泡處理的鉤栗插穗生根率可達(dá)99.7%[5]。植物激素或生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)插穗生根的原因由解剖學(xué)分析與其對根原基的誘導(dǎo)有關(guān)。

紅纓海棠于2017年3月10日被江蘇省林木品種審定委員會審定為良種，可采用扦插方式繁殖[6]。本文將以紅纓海棠嫩枝插穗作為研究材料，使用NAA對插穗進(jìn)行促根處理后扦插于全光照自動噴霧扦插池中，定期取樣插穗基部制作石蠟切片，觀察插穗根原基誘導(dǎo)發(fā)生部位及不定根發(fā)育過程。

1 材料與方法

1.1 嫩枝扦插及管理

2017年7月底，紅纓海棠采穗圃采集半木質(zhì)化枝條制作100根插穗。插穗規(guī)格為長度15 cm左右，保留2～3個芽，插穗上部保留2片半葉，上下切口平截。80根插穗基部使用1 000 mg·L-1NAA溶液浸蘸5 s后，按照10 cm×5 cm間距插入以蛭石為基質(zhì)的全光照間歇噴霧扦插池中，扦插深度為插條長度的1/2；其余20根插穗以清水浸泡作為對照，插于扦插池中。

扦插池每隔20 min噴霧1次，每次噴15 s，陰天酌量減少噴霧頻次和時間。扦插后每隔7 d，使用50%多菌靈可濕性粉劑800倍液對插穗和基質(zhì)噴霧消毒1次。

1.2 取樣、固定、制作切片

扦插后，每隔2 d取樣1次，共取15次；取樣的同時，對插穗外部形態(tài)進(jìn)行觀察。每次取3根插穗，將插穗基部1 cm左右切成小段放于盛有70% FAA固定液的玻璃小瓶中固定。樣品固定24 h后，轉(zhuǎn)移至甘油和95%乙醇（體積比為1∶1）混合液中，軟化處理60 d后取出，制作石蠟切片。

參照侯福林[7]的方法，樣品經(jīng)脫水、透明、滲蠟后即可包埋。使用石蠟切片機(jī)切片，切片厚10 μm，用番紅固綠染色，二甲苯透明，中性膠封藏，制成永久切片，用OLYMPUS顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 插穗生根過程中的外部形態(tài)觀察

扦插4 d后，大多數(shù)插穗下切口處未產(chǎn)生愈傷組織，極少數(shù)插穗切面髓部出現(xiàn)少量愈傷組織突起，呈晶瑩透明狀。扦插8 d后，插穗下切口部位產(chǎn)生腫脹并伴有大量的白色突起。扦插12 d后，部分插穗中下部皮部突起或皮孔出現(xiàn)白點(diǎn)，皮孔開裂，對照處理插穗仍未產(chǎn)生愈傷組織；此外，部分插穗下切口處木質(zhì)部出現(xiàn)不同程度的腐爛狀況。扦插16 d后，少量對照插穗產(chǎn)生愈傷組織，大部分NAA處理插穗產(chǎn)生愈傷組織且體積較大；同時，還發(fā)現(xiàn)部分插穗未產(chǎn)生不定根也無愈傷組織，多數(shù)此類型插穗下切口處出現(xiàn)腐爛。扦插18 d后，插穗分生出大量不定根，不定根根長超過5 cm，具有高位不定根的插穗基部腐爛較為嚴(yán)重。扦插20 d后，約半數(shù)插穗生根。扦插22 d后，大部分插穗生根且不定根生長較長。見圖1。綜合插穗外部形態(tài)觀察，插穗愈傷組織部位和皮部均可產(chǎn)生不定根，其中愈傷組織部位生根較多，判定NAA處理后的紅纓海棠嫩枝扦插生根類型為以愈傷組織生根為主型[6]。

圖1 插穗生根過程中的外部形態(tài)觀察Fig. 1 The external morphology observation of rooting

2.2 扦插前插穗解剖構(gòu)造

圖2 扦插前插穗解剖構(gòu)造Fig. 2 The anatomical structure of stem before cutting

扦插前插穗橫切面層次分明，由外向內(nèi)依次為表皮、皮層、韌皮部、維管形成層、木質(zhì)部、髓，見圖2。由圖2可知，表皮（E）細(xì)胞為規(guī)則的長方形細(xì)胞且排列緊密，染色較深。表皮里面是皮層（C），細(xì)胞為不規(guī)則的卵石形，排列較緊密。次生韌皮部（P）主要由韌皮薄壁細(xì)胞、韌皮纖維及篩管組成，與木質(zhì)部相比，其只占很小的部分。維管形成層（VC）由較小且排列緊密的若干層分生細(xì)胞組成。次生木質(zhì)部（X）所占比例較大，主要由導(dǎo)管和木纖維組成，細(xì)胞木質(zhì)化程度較高。插穗的中央部分是髓（PI），原生木質(zhì)部在髓與次生木質(zhì)部之間，其染色相比次生木質(zhì)部較深。髓部細(xì)胞較大，排列疏松，染色較淺。在髓與木質(zhì)部結(jié)合處存在一條染色較深的波浪狀環(huán)帶，其細(xì)胞與髓部細(xì)胞相比，體積小且排列緊湊，為環(huán)髓帶（PZ）。狹窄的髓射線（PR）從環(huán)髓帶擴(kuò)展到韌皮部，細(xì)胞染色較深。通過石蠟切片觀察，扦插前插穗中不存在根原始體，證實(shí)紅纓海棠枝條內(nèi)不存在潛伏根原基。

2.3 不定根誘導(dǎo)發(fā)生的部位及發(fā)育過程

紅纓海棠嫩枝扦插后，可由插穗愈傷組織和皮部長出不定根，即插穗愈傷組織及皮部均可誘導(dǎo)產(chǎn)生根原基，各處根原基誘導(dǎo)及不定根發(fā)育過程如下：

2.3.1 愈傷組織內(nèi)分化的根原基

愈傷組織生根是樹木嫩枝扦插生根的主要類型之一，通過石蠟切片觀察，紅纓海棠嫩枝扦插主要的生根部位就是愈傷組織。

愈傷組織是扦插后插穗基部的形成層恢復(fù)分裂能力后產(chǎn)生的一種組織，由維管形成層發(fā)育而來，由薄壁細(xì)胞組成[8]。薄壁細(xì)胞個大、近圓形、排列疏松，細(xì)胞核不明顯。愈傷組織在細(xì)胞數(shù)量不斷增加的同時其內(nèi)部的一些細(xì)胞開始分化，伴隨著細(xì)胞壁的增厚一些細(xì)胞分化成輸導(dǎo)組織。愈傷組織內(nèi)的輸導(dǎo)組織一部分是插穗基部維管形成層分裂分化的延續(xù)（圖3A），另一部分獨(dú)立形成于愈傷組織內(nèi)部（圖3C）。

紅纓海棠愈傷組織中可分化形成木質(zhì)部和形成層。在木質(zhì)部外側(cè)，有些細(xì)胞特化形成具有根原始體特征的細(xì)胞，與周圍的愈傷薄壁細(xì)胞有明顯的界限（圖3B），在其發(fā)展過程中，由近圓形的細(xì)胞團(tuán)變成先端較尖的誘發(fā)根原基。這些根原基細(xì)胞繼續(xù)伸長，突破愈傷組織表面伸出體外。伴隨著根原基及不定根的發(fā)育，不定根內(nèi)部維管系統(tǒng)同時發(fā)育，最終與插穗內(nèi)的維管系統(tǒng)相連。扦插后16 d，由愈傷組織形成的不定根伸出插穗。

2.3.2 髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞分化形成根原基

圖3 愈傷組織內(nèi)分化的根原基解剖結(jié)構(gòu)Fig. 3 The anatomical structure of root primordium in the callus

紅纓海棠插穗內(nèi)部髓射線與皮層交界處存在一團(tuán)分裂能力較強(qiáng)的細(xì)胞，該團(tuán)細(xì)胞與周圍的皮層薄壁細(xì)胞明顯不同，細(xì)胞體積小、排列緊密、細(xì)胞質(zhì)濃，染色較深（圖4A）。這團(tuán)細(xì)胞繼續(xù)分裂分化可誘導(dǎo)成根原基，扦插12 d后，根原基發(fā)育成排列緊密的圓球狀細(xì)胞（圖4B）。扦插16 d后，圓球狀的根原基繼續(xù)發(fā)育，一端伸長，形似蝌蚪狀（圖4C）。髓射線與皮層交界處形成的根原基較多地發(fā)生于皮孔附近，由此處根原基發(fā)育形成的不定根可以較容易地由皮孔穿出；若形成根原基的部位不處于皮孔附近，不定根將突破皮層伸出體外，突破皮層時，根原基已發(fā)育成具有根冠、分生區(qū)和伸長區(qū)等較為完整的根尖組織（圖4D）。這種根原基的發(fā)生、發(fā)育與愈傷組織的出現(xiàn)及發(fā)育幾乎同時進(jìn)行，所形成的不定根約在扦插后16～18 d伸出插穗。

圖4 髓射線與皮層交界處根原基的解剖構(gòu)造Fig. 4 The differentiation of root primordium

2.3.3 維管形成層分化形成根原基

紅纓海棠插穗維管形成層具有較強(qiáng)的分裂能力，扦插后約10 d，維管形成層便恢復(fù)強(qiáng)烈的分裂能力，次生木質(zhì)部與韌皮部間有5～6層分生細(xì)胞，形成層帶明顯加寬，細(xì)胞分裂分化更加活躍，向內(nèi)向外分裂出大量的薄壁細(xì)胞。在髓射線與維管形成層交界處的薄壁細(xì)胞具有很強(qiáng)的分裂能力，形成根原基，這些細(xì)胞不斷分裂并伸向皮層，最終發(fā)育成不定根伸出插穗（圖5A、5B）。在突破表皮之前，整個不定根呈圓錐狀，其根冠較為發(fā)達(dá)，既起到保護(hù)分生區(qū)的作用，又有利于突破表皮（圖5C）。由維管形成層處形成的根原基至不定根突破表皮的時間不超過20 d。

圖5 維管形成層根原基的解剖結(jié)構(gòu)Fig. 5 The anatomical structure of root primordium induced by vascular cambium

2.3.4 髓射線與環(huán)髓帶交界處形成根原基

圖6 髓射線與環(huán)髓帶交界處誘發(fā)根原基Fig. 6 The root primordium induced between vascular rays and perimeter

枝條髓射線起源于環(huán)髓帶，環(huán)髓帶細(xì)胞較小、排列緊密、染色較深，細(xì)胞非?；钴S。髓射線端部連接著環(huán)髓帶，沿著環(huán)髓帶呈發(fā)射狀排列。紅纓海棠插穗扦插后，與髓射線交界處的環(huán)髓帶逐漸加寬（圖6A），其細(xì)胞較小，排列整齊緊湊，細(xì)胞分裂形成規(guī)則的帶狀并向木質(zhì)部延伸。此處細(xì)胞分裂延伸至與髓射線的交界處，髓射線加寬（圖6B），形成根原基，此過程僅需8 d。插穗內(nèi)根原基逐步發(fā)育成不定根，穿過維管形成層、韌皮部和皮層，最后突破表皮，此過程約需12 d。

3 討論與結(jié)論

3.1 插穗根原始體類型

插穗形成的不定根是由根原始體發(fā)育而來的，分為潛伏根原始體或誘發(fā)根原始體[1]，有些樹種扦插不定根可產(chǎn)生于兩種根原始體，如桑樹[9]，有些樹木則只存在一種根原始體，如棱角山礬[10]、歐李[11]和華北五角楓[12]插穗均只有誘生根原始體。針對蘋果屬植物扦插研究報(bào)道較多，但涉及扦插不定根發(fā)生解剖學(xué)的研究較少，對于插穗中是否存在潛伏根原始體未開展論證。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅纓海棠扦插前枝條內(nèi)不存在潛伏根原始體，其扦插生根屬于誘導(dǎo)生根型，這與許曉崗對垂絲海棠、海棠果、楸子的研究結(jié)論相符合[8,13-14]。

3.2 插穗誘發(fā)根原基發(fā)生部位

插穗扦插后分化形成的根原始體被稱為誘發(fā)根原始體，它可以由維管形成層、韌皮薄壁組織細(xì)胞、韌皮射線、髓射線及其復(fù)合組織等部位產(chǎn)生，也可在愈傷組織中產(chǎn)生[2]。扦插繁殖過程中，不同樹種誘發(fā)根原始體產(chǎn)生的部位不同，或來源于單一部位或來源于多個部位，如歐李插穗不定根原基起源于髓射線[11]、棱角山礬插穗根原基是由髓射線與形成層交接處的細(xì)胞分化而成[10]、華北五角楓不定根根原基起源于愈傷組織[12]、歐美雜種山楊[15]和柚木[16]不定根根原基起源于維管形成層，沙棘扦插根原基起源于維管形成層細(xì)胞處和韌皮部薄壁細(xì)胞區(qū)域[17]，油茶誘生根源于形成層、韌皮部及愈傷組織等部位[18]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅纓海棠嫩枝插穗誘生根原基可產(chǎn)生于愈傷組織、髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞、維管形成層、髓射線與環(huán)髓帶交界處等4個部位，以往文獻(xiàn)報(bào)道同屬的垂絲海棠插穗誘生根原基形成于愈傷組織[8]，而海棠果插穗愈傷組織內(nèi)卻未發(fā)現(xiàn)根原基，其誘生根原基由初生射線與維管形成層交匯處細(xì)胞的分裂分化形成[13]。如此親緣關(guān)系較近的樹種，插穗誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位卻存在很大差異，分析該問題的原因可能源于三個方面：其一，樹種（品種）間誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位存在很大差異，可能由樹種的遺傳特性所決定，如蒙椴誘生根原基源自髓射線與皮層交界處、愈傷組織、維管形成層，屬于較易生根樹種，而糠椴誘生根原基源自愈傷組織、維管形成層，屬較難生根樹種[19]。其二，扦插處理方法不同導(dǎo)致誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位存在差異，加溫處理的四倍體刺槐硬枝插穗根原基產(chǎn)生于髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞和愈傷組織2個部位，不加溫處理的硬枝插穗根原基則僅產(chǎn)生于愈傷組織[20]；采用立體育苗的桑樹插穗誘發(fā)根原基由維管形成層的薄壁細(xì)胞發(fā)育形成，而常規(guī)綠枝插穗誘發(fā)根原基卻源自愈傷組織[9]；筆者也曾證實(shí)IBA和NAA溶液均可促進(jìn)紅纓海棠插穗愈傷組織生根，NAA處理插穗還可促進(jìn)插穗皮部生根[6]。其三，扦插穗條木質(zhì)化程度不同，誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位存在差異，四倍體刺槐硬枝插穗根原基產(chǎn)生于髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞和愈傷組織2個部位，嫩枝插穗根原基產(chǎn)生于愈傷組織[20]；中國沙棘木質(zhì)化枝條根原基起源于木質(zhì)部中的木射線細(xì)胞，而半木質(zhì)化枝條根原基則發(fā)生于韌皮薄壁細(xì)胞與形成層之間[21]。

3.3 扦插生根的難易與生根類型之間的關(guān)系

插穗中若存在潛伏根原始體，扦插容易生根，扦插后需誘發(fā)根原始體的插穗則不容易生根[2]。筆者前期已經(jīng)證實(shí)紅纓海棠扦插屬于較難生根樹種，不使用生長調(diào)節(jié)劑處理的插穗生根率不足10%，且無皮部生根；使用IBA和NAA處理插穗后可以促進(jìn)插穗生根，且生根多屬于愈傷組織生根型，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示NAA處理有利于誘導(dǎo)插穗皮部生根[6]。同時，扦插生根的難度還與誘發(fā)根原始體部位的數(shù)量有關(guān)，若插穗中誘發(fā)根原基的部位較少，則不宜誘導(dǎo)生根，如歐美雜種山楊由于扦插不定根根原基起源單一導(dǎo)致扦插難生根[15]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，誘發(fā)根原始體發(fā)生部位較多有利于生根，經(jīng)NAA處理的紅纓海棠嫩枝扦插不定根根原基來自于愈傷組織等4個部位，生根率接近70%[6]，這與油茶扦插具有相似之處，其根原基可產(chǎn)生于形成層、韌皮部及愈傷組織等部位，生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)油茶屬于較易生根樹種[18]。凡屬難生根的樹種，插條的不定根絕大多數(shù)是愈傷部位生根[22]。插穗是否形成愈傷組織與插穗生根難易因樹種而不同，柚木嫩枝扦插所形成的愈傷組織與生根呈負(fù)相關(guān)[16]，油茶不定根的發(fā)生與愈傷組織沒有直接關(guān)系[18]，華北五角楓[12]不定根根原基則僅來源于愈傷組織。本實(shí)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，使用NAA和IBA處理插穗后，有利于誘導(dǎo)形成愈傷組織，且促進(jìn)了愈傷組織生根，對于紅纓海棠而言愈傷組織形成有利于扦插生根。

本研究以1 000 mg·L-1NAA溶液對嫩枝插穗進(jìn)行促根處理，于扦插過程中取樣制作石蠟切片，證實(shí)紅纓海棠嫩枝扦插生根屬于誘導(dǎo)生根型，誘生根原基可產(chǎn)生于愈傷組織等4個部位。本實(shí)驗(yàn)僅選用NAA單一濃度促根生根劑，未對NAA其他濃度生根劑和IBA等其他種類生根劑開展對比研究，其他生根劑對于插穗根原基的誘導(dǎo)作用及誘生根原基產(chǎn)生部位有待進(jìn)一步研究。同時，實(shí)驗(yàn)過程中每次取樣的穗條僅為3根，制作石蠟切片的數(shù)量也較為有限，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將加大取樣數(shù)量和切片制作數(shù)量，以驗(yàn)證誘導(dǎo)根原基是否還有其他產(chǎn)生部位。