洪宏海，王 征，林麗英

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，其病理特征為炎性反應(yīng)、炎性因子分泌增多及滑膜細(xì)胞異常增殖，其臨床表現(xiàn)為長期的慢性炎癥浸潤、關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腫大和畸形，且女性發(fā)病率約為1.16%，男性約為0.44%[1]。該病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。目前認(rèn)為炎性反應(yīng)過度激活和滑膜細(xì)胞異常增殖是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最重要的致病機(jī)制[2]。 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、脂多糖(LPS)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等促炎因子刺激關(guān)節(jié)纖維樣滑膜細(xì)胞后激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-1β和金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和骨關(guān)節(jié)破壞[3-5]。人附睪蛋白4(HE4)普遍存在于正常女性生殖道、乳腺、附睪、呼吸道上皮細(xì)胞、腎小管等部位[6-7]。HE4基因位于20號染色體，長度約為12 kb，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成[8]。HE4有著廣泛的生物學(xué)功能，其與精子成熟、天然免疫和腫瘤增殖有關(guān)[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，HE4在調(diào)控增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和p21基因中發(fā)揮著重要作用，可促進(jìn)卵巢癌和胰腺癌增殖[10-11]。但HE4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中表達(dá)及其是否調(diào)控類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞增殖尚未清楚。本研究旨在探討HE4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞中表達(dá)及其診斷價值，以及HE4在滑膜細(xì)胞中調(diào)控PCNA和p21的分子機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年6月至2017年6月在本院治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者(SiHE4組)和骨關(guān)節(jié)置換患者(對照組)共34例。SiHE4組22例，其中男7例，女15例；平均年齡(69.2±4.2)歲，平均病程(8.5±3.4)月；類風(fēng)濕因子(RF)陽性18例，其水平為(141.6±61.4)IU/mL；IgG RF陽性18例(81.8%)，IgM RF陽性6例(27.3%)，IgA RF陽性4例(18.2%)；抗環(huán)瓜氨酸抗體(ACPA)陽性13例(59.1%)，其水平為(135.8±78.6)U/mL。對照組12例，其中男5例，女7例；平均年齡(67.5±5.4)歲；RF水平(4.4±2.2)IU/mL；IgA RF陽性1例(8.3%)；ACPA水平為(4.5±1.9)U/mL。兩組研究對象年齡、性別構(gòu)成、病程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者資料和標(biāo)本收集都嚴(yán)格按照廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2儀器與試劑 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測HE4試劑盒購自北京普利萊公司。實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)的雙鏈嵌合熒光染色試劑和逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自Takara公司。RNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)公司。HE4小分子干擾片段購自銳博公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000購自Invtrogen公司。細(xì)胞培養(yǎng)液購Hyclone公司。細(xì)胞培養(yǎng)皿購自康寧公司。PCNA、p21、β-actin抗體購自CST公司，HE4抗體購自Abcam公司。

1.3方法

1.3.1檢測滑膜成纖維細(xì)胞增殖能力 采用噻唑蘭顏色反應(yīng)法(MTT法)行細(xì)胞增殖活力的測定。其原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色晶體——甲纘，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞MH7A處理至相應(yīng)時間點(diǎn)后，每孔避光加入100 μL的MTT工作液(濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸除上清后每孔加入1 mL二甲基亞砜，用脫色平板搖床搖勻，使甲纘完全溶解，用酶標(biāo)儀測定光密度(OD)570的值。試驗(yàn)中每份樣品設(shè)4個復(fù)孔，至少重復(fù)測量3次。

1.3.2檢測HE4、PCNA和p21水平 采用qRT-PCR檢測HE4、PCNA和p21相對表達(dá)水平。收集處理好滑膜細(xì)胞或是MH7A細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Takara公司的SYBR green試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR條件：95 ℃，30 s，1個循環(huán)；95℃、5 s，60 ℃、 15 s，45個循環(huán)；溶解，95 ℃、0 s，65 ℃、20 s，95 ℃、0 s，1個循環(huán)。qRT-PCR結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)得到的Cp值，使用相對定量的分析方法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正，最后計算出樣品中各mRNA的相對濃度。qRT-PCR引物序列見表1。

1.3.3HE4干擾試驗(yàn) HE4干擾試驗(yàn)具體方法如下：MH7A細(xì)胞種植于6孔板中，待其融合度為50%～60%時，用Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HE4干擾小分子片段，36 h后收集細(xì)胞RNA和蛋白，檢測HE4、PCNA和p21轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。干擾HE4小分子序列見表2。

表1 qRT-PCR引物

表2 HE4干擾序列

1.3.4免疫印跡試驗(yàn)(Western blot) 采用Western blot檢測PCNA和p21蛋白水平，具體方法如下：收集處理好的MH7A細(xì)胞蛋白，進(jìn)行蛋白定量，跑膠。加入PCNA和p21一抗，4 ℃過夜，收集一抗，加入二抗，然后加入化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，拍照。

2 結(jié) 果

2.1干擾HE4后MH7A關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖情況 MTT試驗(yàn)顯示，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞MH7A干擾HE4后，在24、48、72 h都明顯抑制MH7A生長，見表3。

表3 干擾HE4后MH7A在關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的水平

2.2HE4調(diào)控MH7A細(xì)胞增殖的分子機(jī)制 qRT-PCR結(jié)果顯示，PCNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，而p21轉(zhuǎn)錄水平則升高，見表4，表明PCNA和p21參與HE4調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎增殖作用。與此類似，Western blot結(jié)果也表明，干擾HE4后，PCNA蛋白水平下調(diào)，p21蛋白水平明顯上調(diào)，表明HE4可能通過調(diào)控PCNA和p21水平進(jìn)而調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖，見圖1。

表4 干擾HE4后關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中PCNA和p21轉(zhuǎn)錄水平

圖1 干擾HE4后PCNA和p21蛋白水平

2.3滑膜細(xì)胞和血清中HE4水平檢測 qRT-PCR結(jié)果顯示，SiHE4組患者滑膜中HE4水平(2.27±0.26)明顯高于對照組(1.28±0.14),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。此外，Western blot結(jié)果顯示SiHE4患者滑膜細(xì)胞HE4蛋白水平明顯高于對照組患者，見圖2。另外，也收集患者的血清，檢測血清中HE4水平。與滑膜細(xì)胞結(jié)果相似，ELISA檢測結(jié)果顯示SiHE4組患者血清中HE4水平[(101.11±24.05)pmol/L]明顯高于對照組患者[(61.53±14.04)pmol/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 兩組患者滑膜細(xì)胞中HE4蛋白水平

2.4血清中HE4水平對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，曲線下面積(AUC)為0.883，表明血清HE4對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷具有較高的價值。同時ROC曲線分析表明血清HE4對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷的靈敏度和特異度分別為80.0%和83.3%；95%CI為0.762～1.004。同時，Pearson相關(guān)分析顯示，血清HE4與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清RF和ACPA水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.762和0.533(P<0.05)。

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，其基本病理特征為炎性反應(yīng)和滑膜細(xì)胞異常增殖。有研究顯示，在人附睪遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)并成功克隆HE4，其與精子成熟和天然免疫有關(guān)[8]。隨后發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用，并且可作為卵巢癌診斷的標(biāo)志物[10-11]。與HE4促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用類似，研究發(fā)現(xiàn)HE4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜增殖中起著關(guān)鍵作用[9]。目前，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，針對炎性因子IL-1β和IL-6的治療取得一定的效果，但是，在一部分患者中效果較差，表明在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中，除了炎性反應(yīng)外，還存在其他致病因素[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫大和畸形，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療效果較差的關(guān)鍵因素[8]。PCNA是細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其可與細(xì)胞周期蛋白相互作用調(diào)控DNA合成，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖[12]。p21是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控蛋白，具有抑制細(xì)胞周期蛋白激酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[13-14]。本研究結(jié)果顯示，干擾HE4后，PCNA水平下調(diào)，p21水平上調(diào)，表明HE4可能調(diào)控PCNA和p21蛋白進(jìn)而調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖作用，且ROC曲線分析其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷具有一定價值，靈敏度和特異度分別為80.0%和83.3%；進(jìn)一步研究其與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎RF和ACPA水平呈正相關(guān)。但是，HE4調(diào)控PCNA和p21蛋白的具體分子機(jī)制及是否具有抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)還值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，HE4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞和血清中表達(dá)上調(diào)，且與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎RF和ACPA水平密切相關(guān)。ROC曲線分析表明血清HE4對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷具有良好價值。此外，HE4通過調(diào)控PCNA和p21蛋白從而調(diào)控滑膜細(xì)胞增殖作用，這些結(jié)果提示HE4可能成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療新的靶點(diǎn)，具有一定的臨床意義。