張 研， 張海楠， 許 靜， 呂藝蓁， 張 瑾， 彭 菁，李 盼， 喬 希， 劉清華， 4△

(山西醫(yī)科大學 1病理生理教研室， 2第一臨床醫(yī)學院， 3公共衛(wèi)生學院，4細胞生理學省部共建教育部重點實驗室， 山西 太原 030001)

心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFb)是心肌間質(zhì)主要細胞成分，占心臟細胞總數(shù)70%，在維持心臟正常結(jié)構和功能方面起重要作用[1-2]。心臟成纖維細胞的增殖和膠原合成在心肌纖維化中具有至關重要的作用，是病理性心肌纖維化和心室重構的關鍵性調(diào)節(jié)因子[3]。在高血壓性心臟病、缺血性心肌病、冠心病和心力衰竭等心血管疾病中心肌纖維化是心肌重構發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[4]。除了積極治療原發(fā)病，抗纖維化治療也是不容忽視的重要策略。因此，揭示心室重構及心衰產(chǎn)生的分子機制，有效預防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，成為諸多心血管疾病的研究和防治的重要目標。

心室成纖維細胞增殖及間質(zhì)纖維化可造成心室壁僵硬，順應性降低，舒縮功能障礙。除此之外，心肌纖維化還可導致心臟電生理重構，誘導室性心律失常的發(fā)生[5]。既往關于電生理重構的研究大多集中在心肌細胞的離子通道[6]，而對成纖維細胞離子通道在心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展中的作用了解甚少，有待進一步研究。心臟成纖維細胞沒有電興奮，但是它們能夠極化靜息膜電位(resting membrane potential，RMP)[7]。已知在人和大鼠心臟成纖維細胞膜上，表達廣泛的離子通道[8-9]，其中內(nèi)向整流鉀通道(inwardly rectifying potassuim channels，IK1，IKir)主要決定成纖維細胞靜息膜電位。本課題組發(fā)現(xiàn)并報道了首個IK1選擇性激動劑扎考必利(zacopride，Zac)[10]，它可通過特異性增強大鼠心室肌IK1改善異丙腎上腺素誘發(fā)的心室重構[11]。此外,Zac不僅可以逆轉(zhuǎn)心室肌肥厚，還可以拮抗心肌纖維化。Kir2.1是心臟成纖維細胞IK1通道的主要亞單位，我們已證明Zac激動IK1的有效靶點就是Kir2.1 的同源聚合體[12]，提示Zac也可能通過改變心室成纖維細胞IK1而改變間質(zhì)重構。本研究將在細胞水平模擬心肌纖維化，以血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)誘導心臟成纖維細胞活化和膠原表達模型為對象，觀察Zac對成纖維細胞IK1通道表達及細胞活力和凋亡的影響，探討Zac抑制心室間質(zhì)纖維化可能的機制，從而為抗心室重構治療尋找新的藥物作用靶點。

材 料 和 方 法

1 動物

新生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號為SYXK(晉)2015-0001。

2 主要試劑

Zacopride和Ang Ⅱ 購自Tocris；氯喹(chloroquine,Chlo)、卡托普利(captopril,Cap)和小鼠抗Kir2.1單克隆抗體購自Sigma；兔抗GAPDH單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶購自Gibco；其余均為國內(nèi)生產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1乳鼠心室成纖維細胞原代培養(yǎng) 取20 只1～3 d新生乳鼠，用75% 乙醇浸泡消毒。在無菌條件下用彎剪剪開胸壁立即取出心臟，并放入冰冷的PBS液中，切取心室，初步洗去心室內(nèi)的血液后，轉(zhuǎn)移入EP管中，剪成(1～3) mm×1 mm×1 mm的碎塊，靜置5 min后，棄上清以去除紅細胞。采用0.08% 胰酶和0.04%Ⅱ型膠原酶(現(xiàn)用現(xiàn)配，混合比例為1 ∶2)，進行多次消化，每次37 ℃，消化6～8 min，吸取上層的細胞懸液，加入到50 mL離心管(預先加入25 mL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基)中，終止胰酶作用，重復消化直至組織塊消化干凈。收集的細胞懸液800 r/min離心10 min，重懸后200 目濾網(wǎng)過濾，所得細胞培養(yǎng)48 h以使成纖維細胞貼壁，棄去未貼壁的細胞，貼壁細胞繼續(xù)在含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底后，用0.25% 胰酶消化傳代，實驗取傳代2～4代細胞。原代培養(yǎng)的成纖維細胞隨機分成6組：正常對照(control)組、Ang Ⅱ(1 μmol/L)組、Ang Ⅱ+Zac (1 μmol/L)組、Ang Ⅱ+Zac+BaCl2(1 μmol/L)組、Ang Ⅱ+Zac+Chlo (0.3 μmol/L)組和Ang Ⅱ+Cap (10 μmol/L)組，各組細胞分別加藥處理后，培養(yǎng)24 h，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

3.2CCK-8法檢測細胞活力 在96 孔板中配置100 μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h。按上述分組向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測物質(zhì)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h。向每孔加入10 μL CCK-8檢測液，將培養(yǎng)板在敷箱中孵育2～4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A)值。

3.3ELISA法檢測Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量 取第3 代CFb制成細胞懸液，以2.5×108/L的細胞濃度接種于24 孔板，每孔 1 mL。各因素處理后，分別在培養(yǎng)的 48 h后離心吸取細胞上清液按照ELISA 試劑盒說明檢測Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量。

3.4流式細胞術檢測凋亡率 各組細胞加藥培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化細胞，收集細胞并制成1×108/L的細胞懸液，800 r/min離心10 min，棄上清液，PBS 洗滌樣品細胞，過濾，離心，棄上清。根據(jù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙標記試劑盒說明加入染料，避光30 min，上機檢測。

3.5Western blot 法檢測蛋白的表達 提取各組心臟成纖維細胞在冰上加入裂解液，超聲破碎細胞，利用Eppendorf進一步勻漿(12 000 r/min，30 min，4 ℃)。抽取上清液進行分裝。用Bradford比色法測定蛋白濃度，計算上樣量，配置12.5%分離膠和5 %濃縮膠上樣后進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫封閉2 h后加入Ⅰ 抗(Kir2.1抗體稀釋1.5 ∶1 000；GAPDH抗體稀釋1 ∶5 000)，4 ℃ 過夜。TBST清洗3次，每次10 min，后加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，再次清洗3次，每次10 min?；瘜W增強發(fā)光試劑反應，壓片曝光，放入顯影液、定影液，結(jié)果采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對條帶進行處理分析。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 細胞形態(tài)學觀察

在倒置顯微鏡下可見，與對照組相比，分離和培養(yǎng)的乳鼠心臟成纖維細胞，經(jīng)1 μmol/L的Ang Ⅱ 孵育24 h后細胞顯著增殖，生長密集，呈火焰狀；Zac組細胞數(shù)量減少，表明Zac可抑制其增殖，并且與Ang Ⅱ+Cap組無明顯差異；分別用IK1的相對特異性阻斷劑BaCl2和Chlo均可以逆轉(zhuǎn)其效應；表明Zac可顯著降低Ang Ⅱ誘發(fā)的心臟成纖維細胞增殖,見圖1。

2 Zac對心臟成纖維細胞活力的影響

CCK-8 比色法檢測不同藥物干預心臟成纖維細胞24 h 后各組細胞活力的變化。如圖2 所示，心臟成纖維細胞給予Ang Ⅱ 處理24 h 后，與對照組相比A值顯著增加，Zac處理后可顯著抑制其上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；用IK1阻斷劑BaCl2和Chlo后，A值降低，說明Zac對Ang Ⅱ誘導的CFs 活力有抑制作用。

3 Zac對心臟成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量的影響

各處理因素作用24 h后，Ang Ⅱ模型組細胞Ⅰ 型膠原和Ⅲ型膠原含量明顯高于對照組(P<0.05)；Zac可抑制Ang Ⅱ 誘導的膠原合成增加(P<0.05)；適當劑量氯喹和BaCl2選擇性阻斷IK1可消除Zac 的作用，見圖3。

Figure 1. The effect of Zac on the morphological changes of the neonatal rat cardiac fibroblasts observed under microscope (×200).

圖1Zac對乳鼠心臟成纖維細胞形態(tài)的影響

Figure 2. The changes of the viability of AngⅡ-treated cardiac fibroblasts detected by CCK-8 assay. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡ group;△P<0.05vsAngⅡ+Zac group.

圖2Zac對AngⅡ誘導的CFb活力的影響

4 Zac對心臟成纖維細胞凋亡的影響

乳鼠心肌成纖維細胞凋亡流式檢測結(jié)果顯示，與對照組和Ang Ⅱ組相比，Zac干預后明顯增加成纖維細胞的凋亡(P<0.05);運用BaCl2和Chlo可阻斷Zac的效應，說明Zac促成纖維細胞凋亡是通過特異性激動IK1介導的，促凋亡可能是其發(fā)揮抗心肌纖維化的重要機制，見圖4。

Figure 3. The effects of Zac on secretion of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in the cardiac fibroblasts. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ group;△P<0.05vsAng Ⅱ+ Zac group.

圖3Zac對AngⅡ誘導的心臟成纖維細胞膠原合成的影響

Figure 4. Zac promoted the apoptosis of cardiac fibroblasts in neonatal rats. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ group;△P<0.05vsAngⅡ+Zac group.

圖4Zac可促進乳鼠心臟成纖維細胞凋亡

5 Zac對Kir2.1通道蛋白表達的影響

如圖5所示，血管緊張素Ⅱ可明顯抑制Kir2.1表達，Zac干預后可使Kir2.1表達增加(P<0.05);BaCl2和Chlo可阻斷Zac的上述效應，說明Zac抑制心肌纖維化可能是通過選擇性激動IK1通道介導的?？ㄍ衅绽⒉荒茉鰪夾ngⅡ處理后成纖維細胞中Kir2.1表達，提示其抗纖維化效應不是通過IK1通道介導的。

Figure 5. The effects of Zac on the protein expression of Kir2.1 in neonatal rat cardiac fibroblasts treated with Ang Ⅱ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ group;△P<0.05 Ang Ⅱ+Zac group.

圖5Zac對AngⅡ孵育乳鼠心臟成纖維細胞Kir2.1蛋白表達的影響

討 論

心室重構不僅表現(xiàn)為心肌細胞的變化，同樣還表現(xiàn)為間質(zhì)細胞的變化。心肌間質(zhì)主要是由成纖維細胞分泌的膠原纖維圍繞著心肌細胞形成的膠原網(wǎng)絡和散布其中的心肌間質(zhì)細胞組成，對心肌細胞起著支架保護、連接固定、力學傳導以及供給營養(yǎng)的作用[13]。纖維化是多種心臟病的共同特征，心臟成纖維細胞已經(jīng)被證明對產(chǎn)生和調(diào)節(jié)纖維化有顯著貢獻[14]。心臟成纖維細胞過度增殖，將導致膠原蛋白過量積聚。生理狀態(tài)下心肌膠原纖維如Ⅰ型、Ⅲ型膠原能確保相鄰心肌細胞結(jié)構完整性，保障心肌細胞收縮并完成整體左室泵功能。心肌纖維化時主要表現(xiàn)為各型膠原比例失衡，膠原蛋白含量增加及其結(jié)構重排，進而影響心臟功能，最終導致心力哀竭的發(fā)生[15]。因此，維持心臟成纖維細胞正常比例與功能對保證心臟功能的正常進行具有重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，Zac可明顯降低膠原的含量，抑制心肌成纖維細胞增殖，減輕纖維化。

血管緊張素Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要作用因子之一，參與多種心臟疾病的病理發(fā)生過程，可誘導心肌細胞肥大和心肌間質(zhì)纖維化，是調(diào)節(jié)心肌纖維化和心室重構的重要因素[16]。在各種心臟疾病過程中，Ang Ⅱ不僅刺激心肌細胞肥大、對心肌成纖維細胞增生及間質(zhì)心肌纖維化也有作用，而后2種病理過程將增加非肌細胞間質(zhì)的成分，造成心室壁僵硬，順應性降低，舒縮功能障礙，最終引發(fā)心力衰竭[17]。同時局部Ang Ⅱ產(chǎn)生增加與心肌細胞凋亡和反應性間質(zhì)性纖維化有關[18]。本研究中采用Ang Ⅱ孵育CFb 24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ可以刺激CFb的細胞活力和膠原合成增加，促進心肌纖維化，并降低心臟成纖維細胞凋亡；同時應用Zac能夠降低Ang Ⅱ誘發(fā)的CFb增殖和膠原合成，誘導凋亡，提示具有抗心肌纖維化作用。心臟成纖維細胞的電生理特性將影響其激發(fā)分泌耦合，成纖維細胞—肌細胞偶聯(lián)以及成纖維細胞—成纖維細胞相互作用的能力。心肌細胞的靜息膜電位通常約為-80 mV，但成纖維細胞具有更多的陽性靜息膜電位。據(jù)報道，使用常規(guī)細胞內(nèi)微電極記錄，心臟成纖維細胞原位靜息膜電位在-31～-16 mV之間[19]。然而對于哪些通道決定心臟成纖維細胞中的靜息膜電位并不是完全了解。由Kir2.1(IK1的亞單位之一)編碼的內(nèi)向整流鉀電流IK1可能有助于靜息膜電位[19]。研究表明，在成年大鼠心室肌成纖維細胞和肌成纖維細胞中，Kir電流是RMP的主要決定因素[19]。有研究表明，通過操縱大鼠心室成纖維細胞中IK1電流振幅的靜息膜電位的變化將影響肌成纖維細胞增殖；在狗快速起搏誘發(fā)的心力衰竭，心房成纖維細胞Kir2.1通道功能和表達上調(diào)，促進了成纖維細胞增生，進而形成心房重構和房顫的結(jié)構基礎[20-21]。已知心衰時，心房肌細胞IK1上調(diào)是心房重構和致房顫的電生理學基礎之一。這些結(jié)果說明心衰時心房成纖維細胞IK1與心房肌細胞具有相似的電生理學改變，都參與心房的電重構和結(jié)構重構，具有協(xié)同效應。與此相反，IK1下調(diào)是心衰時心室肌電重構的重要特征[22]，激動IK1理論上具有抗心肌重構的作用。在本實驗中，我們分離并培養(yǎng)乳鼠心室成纖維細胞，給予AngⅡ后可以下調(diào)Kir2.1，誘導成纖維細胞活力增加，經(jīng)Zac干預能夠上調(diào)Kir2.1，抑制其生長并誘導其凋亡。

綜上所述，本研究建立AngⅡ致心肌纖維化和心室重構模型，利用IK1通道激動劑Zac和相對特異性IK1通道阻斷劑氯喹與BaCl2，證明選擇性激動IK1通道可能通過降低成纖維細胞的活力并誘導其凋亡而發(fā)揮抗心室重構效應，從而在細胞和分子水平為心室重構病理過程中心肌纖維化提供新的理論依據(jù)，也為防治和逆轉(zhuǎn)心室重構開辟新的途徑。