劉麗敏， 鐘華紅， 鄧宏偉， 肖紅萍， 曾杞汶， 田 原， 劉小勇， 孟 晶△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科， 廣東 廣州 510632； 2暨南大學(xué)附屬深圳眼科醫(yī)院， 廣東 深圳 518040)

高度近視幼兒長期口服含越橘花青素(bilberry anthocyanins)的遞法明片劑，其眼軸增長以及近視的進(jìn)展可被延緩[1]。前期動物模型實(shí)驗(yàn)顯示越橘花青素能夠抑制豚鼠形覺剝奪性近視的眼軸增長，使鞏膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶 2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)表達(dá)減少及I型膠原蛋白(collagen type I,collagen I)表達(dá)增加[2]。本研究以人胚胎鞏膜成纖維細(xì)胞(human fetal scleral fibroblasts，HFSF)為研究對象，探討越橘花青素對HFSF近視相關(guān)蛋白MMP-2和collagen I表達(dá)的影響，為深入研究近視信號通路尋找突破點(diǎn)，并為近視的藥物治療尋找新的方法。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人胚胎鞏膜成纖維細(xì)胞由中山大學(xué)眼科中心惠贈。

2 試劑

越橘花青素凍干粉(從歐洲越橘果實(shí)提取的混合物，花青素含量占其總重量的55%)由法國樂康美的瀾制藥廠惠贈；Western封閉液、蛋白彩色Marker、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液(5×)和 BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)購于碧云天生物工程有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)和SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購于TaKaRa；所用引物由上海生物股份有限公司合成，見表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

3 方法

3.1HFSF的復(fù)蘇、傳代與培養(yǎng) 將HFSF復(fù)蘇、常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長接近80%～90%融合時進(jìn)行傳代培育，倒置相差顯微鏡下察看細(xì)胞的密度及形態(tài)。

3.2MTT法檢測越橘花青素對HFSF活力的影響 將越橘花青素依次配制為0、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1和1 g/L各濃度組[3]，其中0 g/L為實(shí)驗(yàn)對照組，不含HFSF的培養(yǎng)液為空白對照組，分別培養(yǎng)6 h、8 h、12 h、24 h和48 h后噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法檢測HFSF增殖，每組濃度設(shè)3個平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測越橘花青素對HFSF細(xì)胞周期和凋亡的影響 MTT檢測HFSF活力最高時越橘花青素的濃度為實(shí)驗(yàn)組，0 g/L為對照組，DMEM高糖培養(yǎng)液分別培養(yǎng)HFSF 12 h， 碘化丙啶(propidium iodide，PI)單染法檢測細(xì)胞周期，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4RT-qPCR檢測HFSF中MMP2、 COL1A1和COL1A2 mRNA的表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的接近融合的細(xì)胞，消化、離心、制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，每個培養(yǎng)瓶加3 mL細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下觀察，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，吸除原培養(yǎng)液，用含10-1g/L越橘花青素的DMEM高糖培養(yǎng)液分別處理細(xì)胞12 h，不含越橘花青素組為對照組，應(yīng)用RT-qPCR分別檢測HFSF中MMP2、COL1A1 和COL1A2 mRNA表達(dá)，每組設(shè)3個復(fù)孔。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量。

3.5Western blot檢測HFSF中MMP2和collagen I蛋白的表達(dá) 按照上述方法培養(yǎng)HFSF，應(yīng)用Wes-tern blot分別檢測2組HFSF中MMP2和collagen I蛋白表達(dá)，每組設(shè)3個復(fù)孔。用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定提取的總蛋白含量及濃度。20 μL蛋白裂解液中加入5 μL 2×SDS-PAGE Loading Buffer混勻，100 ℃煮沸5 min；采用10% SDS-PAGE，每泳道30 μg蛋白量加樣，電壓140 V電泳1.5 h；電流350 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1 h，將SDS-PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜使用BSA室溫封閉2 h，200倍稀釋的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；PBST洗滌4次后，Ⅱ抗室溫孵育1 h；PBST洗滌5次，化學(xué)發(fā)光法顯影。掃描膠片，Quantity One軟件分析條帶灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HFSF的鏡下形態(tài)

倒置相差顯微鏡下觀察，剛貼壁的HFSF密度較低，輪廓清晰，形態(tài)多呈三角形或星形、網(wǎng)狀排列；生長過程中細(xì)胞逐漸延伸至梭形，呈束狀或旋渦狀排列，見圖1。

Figure 1. The morphological changes of HFSF observed under inverted microscope (×50). A: 48 h after inoculation; B: 96 h after inoculation.

圖1倒置顯微鏡下觀察HFSF的形態(tài)

2 越橘花青素對HFSF活力的影響

MTT檢測顯示，不同作用濃度、作用時間及不同組合間的細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；濃度為10-1g/L的越橘花青素作用12 h， HFSF活力最高(P<0.05)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。

Figure 2. The promoting effect of bilberry anthocyanins on the viability of HFSF. Mean±SD.n=12.*P<0.05vs0 g/L group.

圖2越橘花青素對HSFS活力的促進(jìn)作用

3 越橘花青素對HFSF細(xì)胞周期的影響

PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(10-1g/L越橘花青素作用12 h)和對照組(0 g/L)中，S+G2期細(xì)胞所占百分比分別為(28.92±1.69)%和(22.41±1.42)%，實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3、表2。

4 越橘花青素對HFSF凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法檢測顯示，越橘花青素濃度10-1g/L、作用時間12 h的實(shí)驗(yàn)組與對照組的凋亡率分別為(2.0±0.2)%和(2.1±0.2)%，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

5 越橘花青素對HFSF中MMP2、COL1A1和COL1A2 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MMP2的mRNA表達(dá)量較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，見圖5；COL1A1的mRNA表達(dá)量較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，見圖6；而COL1A2的mRNA表達(dá)量與對照組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖7。

6 越橘花青素對HFSF中MM2和collagen I蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組和對照組蛋白表達(dá)量比較，MMP2蛋白表達(dá)減少，collagen I蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，見圖8。

討 論

近視的發(fā)生機(jī)制至今尚不清楚，但較為公認(rèn)的理論是鞏膜重塑機(jī)制。我們前期的研究表明，在形覺剝奪性近視的動物模型中，越橘花青素延緩眼球增長和負(fù)向屈光不正的作用機(jī)制是通過抑制后極部鞏膜MMP2的mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)collagen I的mRNA和蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)剝奪眼的鞏膜重塑過程[3]。越橘花青素屬生物黃酮類化合物，具備抗氧化、抗輻射、抗炎癥、抗動脈硬化、抗腫瘤、調(diào)理抗氧化酶系統(tǒng)的表達(dá)及維護(hù)眼球健康和視覺生理等多種功能[4-6]。不同花青素對各種細(xì)胞組織的作用不同。有研究證實(shí)，葡萄籽原花青素可使高血壓心肌組織collagen I 表達(dá)增加[7]；藍(lán)莓提取物花青素使氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞中collagen I表達(dá)減少[8]；原慧萍等[9]研究顯示花青素具有拮抗視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞微波損傷凋亡的作用。正常或近視鞏膜中分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞是HFSF，因此本實(shí)驗(yàn)選取HFSF為對象設(shè)計離體實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平探討越橘花青素對HFSF中MMP2及collagen I表達(dá)的影響。

Figure 3. The effect of bilberry anthocyanins on the cell cycle of HFSF.

圖3越橘花青素對HFSF細(xì)胞周期的影響

表2 HFSF細(xì)胞周期的比較

**P<0.01vscontrol group.

Figure 4. The effect of bilberry anthocyanins on the apoptosis rate of HFSF. Mean±SD.n=12.

圖4越橘花青素對HFSF凋亡的影響

Figure 5. The effects of bilberry anthocyanins on the mRNA expression of MMP2 in HFSF. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 g/L group.

圖5越橘花青素對HFSF中MMP2mRNA表達(dá)的影響

Figure 6. The effect of bilberry anthocyanins on the mRNA expression of COL1A1 in HFSF. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 g/L group.

圖6越橘花青素對HFSF中COL1A1mRNA表達(dá)的影響

Figure 7. The effect of bilberry anthocyanins on the mRNA expression of COL1A2 in HFSF. Mean±SD.n=4.

圖7越橘花青素對HFSF中COL1A2mRNA表達(dá)的影響

Figure 8. The effect of bilberry anthocyanins on the protein expression of MMP2 and collagen I in HFSF tested by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 g/L group.

圖8Westernblot檢測越橘花青素對HFSF中MMP2和collagenI蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)使用0、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1 g/L濃度的越橘提取物作用于HFSF 6 h、8 h、12 h、24 h和48 h后，通過MTT法檢測出，細(xì)胞活力最高的作用時間為12 h，培育濃度為10-1g/L。流式細(xì)胞分析圖的Q2-LL區(qū)為正常細(xì)胞，Q2-LR區(qū)顯示為早期凋亡細(xì)胞比例，Q2-UR區(qū)顯示為晚期凋亡細(xì)胞比例，Q2-UL區(qū)顯示為機(jī)械損傷細(xì)胞比例。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，10-1g/L越橘花青素組S+G2期的HFSF細(xì)胞比例增加。此外，與對照組(0 g/L)相比，10-1g/L越橘花青素組(實(shí)驗(yàn)組)對HFSF凋亡率沒有影響。

鞏膜是視覺信號通路的終點(diǎn)，鞏膜膠原成分占鞏膜總干重的90%左右，其中主要分布于赤道和后極部之間的collagen I占鞏膜總膠原量的絕大部分。Collagen I是人體中最豐富的膠原蛋白，廣泛存在于軟骨、骨、肌腱、皮膚和眼球的鞏膜等結(jié)構(gòu)中，形成嗜酸性的大膠原纖維，起到加強(qiáng)并支持結(jié)構(gòu)的作用[10]。Collagen I的主要成分包含alpha-1和alpha-2兩種單鏈，分別由COL1A1和COL1A2基因編碼，二者表達(dá)生成的2條alpha-1單鏈和1條alpha-2單鏈，組合后形成I型原膠原蛋白[11-12]。鞏膜的重塑需要其基質(zhì)合成和降解之間的精細(xì)平衡。基質(zhì)金屬蛋白酶是一系列能降解多種大分子的酶，其中MMP2能降解鞏膜中成分最多的天然形式的collagen I。形覺剝奪性近視雞多個研究表明，形覺剝奪眼在早期(4 d)MMP2 mRNA 含量即有增加，而恢復(fù)期其含量會減少，從而證明鞏膜MMP2 表達(dá)水平與近視的發(fā)生明顯相關(guān)[13]。Gentle等[14]采用樹鼠作為近視模型動物，檢測出近視眼中collagen I mRNA含量與對照眼相比顯著減少，說明MMP2和collagen I在近視的發(fā)展過程中密切相關(guān)。

我們選取MTT法檢測細(xì)胞活力最高的濃度10-1g/L的越橘花青素作為實(shí)驗(yàn)組，0 g/L越橘花青素組為對照組，作用于HFSF進(jìn)行RT-qPCR及Wes-tern blot測定，分別從mRNA及蛋白水平檢測MMP2和collagen I表達(dá)。結(jié)果顯示越橘花青素作用組MMP2表達(dá)量下降，collagen I表達(dá)量增加。從細(xì)胞水平證實(shí)了越橘花青素可對體外培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細(xì)胞的MMP2表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，使其mRNA含量及蛋白合成量均下降，促進(jìn)collagen I mRNA及蛋白表達(dá),與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。對于越橘花青素具體通過何種通路誘導(dǎo)HFSF表達(dá)collagen I蛋白，有待進(jìn)一步深入探討。