葉倩宸， 陳業(yè)偉， 傅政民， 李曉鈿， 馮琳遠， 楊曉蘋， 冉艷紅， 李弘劍

(暨南大學生命科學技術學院， 廣東 廣州 510632)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)屬于β皰疹病毒，在人群中感染率高，在發(fā)達國家有50%的感染率，而在多數(shù)發(fā)展中國家感染率則高達100%[1]。在美國，每年有2～3萬名嬰兒感染HCMV，而在印度等發(fā)展中國家，則超過25萬名；受感染嬰兒中有30%呈HCMV先天性感染[2]。感染HCMV是發(fā)達國家胎兒先天性畸形最常見的原因，也會導致胎兒神經發(fā)育遲緩，胎兒或新生兒死亡，肺炎、支氣管發(fā)育不良、神經系統(tǒng)后遺癥和感覺神經性耳聾等疾病[3]。HCMV通常呈隱性感染，健康的人群感染后沒有明顯癥狀。免疫功能不全的個體或者當機體免疫力低下時，HCMV感染會導致視網膜炎、腦炎、肝炎、黃疸、聽力損害，動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生甚至危及生命[4]。

UL23是HCMV的皮層蛋白，聚集在細胞質中的核周邊區(qū)域，其基因屬于US22基因家族的一員。US22基因家族包括12個成員：UL23、UL24、UL28、UL29、UL36、UL43、TRS1、IRS1、US22、US23、US24和US26，這些基因廣泛參與病毒的生長增殖過程[5]。目前對UL23的功能研究并不多，前期發(fā)現(xiàn)UL23可以和胰島素樣生長因子結合蛋白4(insulin-like growth factor binding protein 4,IGFBP4)以及ATP酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1, ATIF1)相互作用[6-7]。課題組前期工作中，以人巨細胞病毒蛋白UL23為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與其相互作用的干擾素誘導蛋白N-Myc相互作用因子(N-Myc interactor, Nmi)[8]。

Nmi是干擾素誘導蛋白，被首次發(fā)現(xiàn)于1996年。Nmi的結構可分Coiled-Coil、NID1和NID2 3個部分[9]。Nmi與人干擾素誘導蛋白IFP35同源，并通過相互作用增強IFP35的穩(wěn)定性[10]。除此之外，Nmi還會與多種蛋白相互作用，包括IFN信號通路中的核心蛋白信號轉導及轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT;除STAT2 外)、乳腺癌1號基因、組蛋白乙?；D移酶Tip60、讀碼框移位蛋白(alternative reading frame protein,ARF)、性別決定區(qū)Y框蛋白10和酪蛋白激酶2-相互作用蛋白1等[9]。課題組前期通過酵母雙雜交實驗表明UL23可以與干擾素誘導蛋白Nmi相互作用，且Nmi與UL23相互作用的關鍵區(qū)域位于Nmi 的NID2結構上[8]。在此基礎上，本文的研究進一步證實干擾素誘導蛋白Nmi與人巨細胞病毒皮層蛋白UL23相互作用的現(xiàn)象，探討了Nmi與UL23相互作用的區(qū)域。本文的實驗結果為研究UL23的功能奠定了基礎，也為研究HCMV的潛伏感染機制提供了思路。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

宮頸癌細胞HeLa、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞為本實驗室保存。質粒pGEX-4T-1、pGEX-4T-1-Nmi、pcDNA4-Myc、pcDNA4-Nmi-Myc和pcDNA3.1(+)-UL23-Flag本實驗室保存。限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ及預染蛋白分子量標準Marker購自Thermo Fisher Scientific；T4 DNA連接酶購自TaKaRa；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和PCR產物清潔試劑盒購自Omega；Fast Pfu DNA高保真聚合酶購自全式金公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；DNA分子量標準 Marker 購自廣州東盛生物科技有限公司； ECL發(fā)光液購自Millipore；谷胱甘肽(GSH)瓊脂糖珠和Protein A/G購自Life；Lipofectamine 2000和Myc單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；Flag單克隆抗體購自Proteintech；羊抗鼠Ⅱ抗和羊抗兔Ⅱ抗購自碧云天公司。引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1、2。

表1 截短突變型Nmi PCR引物

The underlined italics denote the restriction enzyme cutting sites.

表2 缺失突變型Nmi PCR引物

The underlined italics denote the restriction enzyme cutting sites.

2 主要方法

2.1截短突變型Nmi克隆的構建 根據NCBI的GenBank中收錄的Nmi基因序列(序列號NM_004688)設計引物，引物設計如表1所示，上游引物含BamHⅠ酶切位點，下游引物含XhoⅠ酶切位點。以pcDNA4-Nmi-Myc為模板，通過PCR擴增兩端帶有酶切位點的目的片段。反應程序為：95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s的程序進行35個循環(huán)；72℃ 10 min。純化后的PCR擴增產物和經過BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切后的表達載體質粒pGEX-4T-1，在T4連接酶的作用下，與帶有黏性末端的目的片段16 ℃連接過夜制備克隆連接液。將連接液轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞后，挑取陽性克隆進行雙酶切鑒定，并對陽性質粒進行測序分析。

2.2缺失突變型Nmi克隆的構建 分別以5個、6個和11個氨基酸為單位，設計Nmi各個缺失型片段的上下游引物(見表2)來構建缺失突變型Nmi克隆。構建缺失192～202 aa這11個氨基酸的Nmi是以pcDNA4-Nmi-Myc為模板，設計引物分別擴增N端帶有BamHⅠ酶切位點的Nmi_1aa-191aa和C端帶有XhoⅠ 酶切位點的Nmi_203aa-307aa這兩段基因片段，擴增程序為：95℃ 5 min；95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s的程序進行35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。得到相應的目的片段純化后和經過BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切過的載體質粒pcDNA4-Myc，利用同源重組方法50 ℃反應15 min。連接液轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞后提取陽性質粒進行雙酶切鑒定，并對陽性質粒進行測序分析。其余2個缺失突變型克隆的構建均參考以上方法。

2.3細胞培養(yǎng)和轉染 HeLa細胞使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。細胞轉染步驟嚴格按Lipofectamine 2000說明書操作。

2.4GST-pulldown實驗 將pGEX-4T-1和pGEX-4T-1-Nmi以及截短突變型Nmi原核表達載體分別轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆到帶有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)，直到A600為0.6～0.8。加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，25 ℃、150 r/min誘導5 h，收集菌體進行超聲破碎。GSH瓊脂糖珠用預冷的細菌裂解液清洗3次，加入超聲破碎后的上清，4℃條件下，旋轉培養(yǎng)器上孵育2 h。孵育結束后清洗5次，加入轉染有UL23-Flag的全細胞裂解液混合，4℃孵育過夜，后清洗10次。Western blot法分析結果。

2.5免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP) 將pcDNA3.1(+)-UL23-Flag分別與pcDNA4_NmiΔ192aa-197aa-Myc(缺失Nmi的第192～197位氨基酸)、pcDNA4-Nmi_Δ197aa-201aa-Myc(缺失Nmi的197～201位氨基酸)和pcDNA4-Nmi_Δ192aa-202aa-Myc(缺失Nmi的第192～202位氨基酸)質粒共轉染入HeLa細胞，36 h后裂解細胞，離心后收集上清，加入Flag抗體，4 ℃孵育過夜。再與預處理后的ProteinA瓊脂糖珠在4 ℃條件下孵育過夜。孵育結束后，用Western blot及IP裂解液清洗5～7次，最后用Western blot法分析結果。

2.6Western blot 收集含有總蛋白的細胞裂解液，或者收集附著有蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖珠和Protein A瓊脂糖珠緩沖液，按照比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，煮沸10～15 min，離心后取上清。經10% SDS-PAGE分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，隨后用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h。經過封閉的PVDF膜分別與含有Flag抗體、Myc抗體或α-tubulin抗體的抗體稀釋液在4 ℃條件下孵育過夜。TBST洗膜3次，每次20 min。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體或羊抗兔抗體4 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次20 min。ECL顯色發(fā)光，凝膠成像儀拍照分析。

結 果

1 截短突變型Nmi目的基因的擴增和重組質粒的鑒定

根據NCBI上已公布的Nmi(GenBank：NM_004688)的基因序列，將Nmi上NID2結構域劃分成10個截短突變型片段。以pcDNA4-Nmi-Myc(全長)為模板，分別通過PCR進行擴增。10個截短突變型Nmi的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后結果顯示，PCR擴增出的基因條帶均與目的基因條帶分子量吻合，見圖1A。挑取單克隆，提取對應質粒進行雙酶切鑒定，鑒定結果如圖1B所示，表明各截短突變型Nmi成功插入載體。經酶切鑒定后的質粒送生工生物公司測序，測序結果顯示截短突變型Nmi重組質粒構建成功。

2 缺失突變型Nmi目的基因的擴增和重組質粒鑒定

根據實驗結果，將Nmi上第192～202位氨基酸劃分成3個缺失型片段，以pcDNA4-Nmi-Myc(全長)為模板，PCR擴增出5個不同長度的Nmi片段，PCR產物分子量大小與預期一致，結果顯示不同長度的Nmi片段通過PCR擴增成功，見圖1C。

提取陽性單克隆的質粒進行雙酶切鑒定，結果如圖1D所示，陽性重組質粒經雙酶切得到的片段與缺失突變型Nmi分子量一致，表明目的片段成功插入載體。測序的結果證實缺失突變型Nmi真核表達載體構建成功。pcDNA4-Nmi_Δ192aa-197aa-Myc表示缺失Nmi的第192位～197位氨基酸，其余2個缺失突變型克隆均采用此法表示。

Figure 1. Indicated fragments amplified by PCR and identification of recombinant plasmids with restriction enzyme. A: truncatedNmifragments amplified by PCR.1～10: Nmi_1aa-192aa, Nmi_1aa-202aa, Nmi_1aa-212aa, Nmi_1aa-222aa, Nmi_1aa-232aa, Nmi_1aa-252aa, Nmi_1aa-262aa, Nmi_1aa-272aa, Nmi_1aa-282aa, Nmi_1aa-292aa, respectively. B: recombinant plasmids digested byBamHⅠ andXhoⅠ. 1～10: pGEX-4T-1-Nmi_1aa-192aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-202aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-212aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-222aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-232aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-252aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-262aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-272aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-282aa, pGEX-4T-1-Nmi_1aa-292aa, respectively. C:Nmideletion fragments amplified by PCR. 1～5: Nmi_1aa-191aa， Nmi_1aa-196aa， Nmi_198aa-307aa， Nmi_202aa-307aa， Nmi_203aa-307aa, respectively.D: identification of recombinant plasmids aboutNmideletion mutants digested byBamHⅠ andXhoⅠ. M: marker.1～3: pcDNA4-Nmi_Δ192aa-197aa, pcDNA4-Nmi_Δ197aa-201aa, pcDNA4-Nmi_Δ192aa-202aa.

圖1截短突變型Nmi克隆和缺失突變型Nmi克隆的構建

3 GST-pulldown法探究Nmi與UL23相互作用的位點

將pGEX-4T-1(GST)、pGEX-4T-1-Nmi以及C端截短突變型pGEX-4T-1-Nmi原核表達載體轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞。含原核表達載體pGEX-4T-1(GST)、 pGEX-4T-1-Nmi以及截短突變型Nmi的Rosetta菌株經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導后分別表達出分子量大小與預期相吻合的蛋白，說明12個目的蛋白成功誘導表達。誘導前的菌種所表達的蛋白如圖2A和圖2B所示,誘導后的菌種蛋白表達如圖2C和圖2D所示。

Figure 2. SDS-PAGE analysis of the fusion protein expression induced with IPTG. A and B: bacteria induced without IPTG; C and D: bacteria induced with 0.2 mmol/L IPTG.

圖2截短突變型GST-Nmi蛋白的誘導表達

經GSH瓊脂糖珠親和層析純化之后，相應的目的蛋白均有一定的富集，并且只含有目的蛋白條帶，說明GST蛋白、GST-Nmi蛋白和截短突變型GST-Nmi蛋白在體外能夠得到有效的純化，結果如圖3A所示。GSH瓊脂糖珠親和層析純化后的12個目的蛋白與真核表達載體表達的融合蛋白UL23-Flag混合、孵育、清洗，通過 Western blot進行檢測。真核表達載體表達的融合蛋白UL23-Flag結果如圖3B所示。GST蛋白與融合蛋白UL23-Flag的pulldown結果為陰性對照，GST-Nmi蛋白與融合蛋白UL23-Flag的pulldown結果為陽性對照，在所有的截短突變型GST-Nmi蛋白中，只有GST-Nmi_1aa-192aa這段蛋白不能在體外與融合蛋白UL23-flag相互作用(圖3A)，從而初步篩選出Nmi與UL23相互作用的區(qū)域為Nmi上第192～202位氨基酸。

Figure 3. Identification of domains on Nmi that mediate the interaction with UL23 by GST-pulldown test. A: SDS-PAGE analysis of purified fusion proteins (top panel) stained by Coomassie brilliant blue, and Western blot results showing abilities about full-length Nmi and its mutants to interact with UL23-Flag (bottom panel); B: pcDNA3.1(+)-UL23-Flag and pcDNA3.1(+) transfected into HeLa cells. The cell lysates were immunoblotted with anti-Flag.

圖3GST-Pulldown檢測Nmi與UL23的相互作用區(qū)域

4 免疫共沉淀法驗證Nmi與UL23相互作用的區(qū)域

將pcDNA3.1(+)-UL23-Flag分別與pcDNA4和野生型Nmi及缺失突變型Nmi共轉染到HeLa細胞中。收集細胞裂解液與Protein A/G瓊脂糖珠、Flag抗體孵育后檢測蛋白的相互作用情況。以pcDNA4與UL23-Flag的體內相互作用作為陰性對照，融合蛋白Myc-Nmi與融合蛋白UL23-Flag的體內相互作用作為陽性對照，實驗結果如圖4所示，融合蛋白UL23-Flag能夠在各實驗組中表達，野生型Nmi和缺失型突變Nmi均能表達。免疫共沉淀實驗結果表明，陽性對照中融合蛋白Myc-Nmi能與融合蛋白UL23-Flag相互作用，再一次證實Nmi可與UL23相互作用。過表達Myc-Nmi_Δ192aa-197aa(即Myc-Nmi缺失第192～197位氨基酸)和Myc-Nmi_Δ197aa-201aa(即Myc-Nmi缺失第197～201位氨基酸)均能與UL23-Flag相互作用。融合蛋白Myc-Nmi_Δ192aa-202aa(即Myc-Nmi缺失第192～202位氨基酸)不能與融合蛋白UL23-Flag在體內發(fā)生相互作用，與GST-pulldown實驗的結果相一致，見圖5。

討 論

人巨細胞病毒在人群中呈普遍性感染，同時HCMV也與多種疾病的發(fā)生均有密切關聯(lián)，因而HCMV感染的診斷和治療顯得尤其重要。本研究通過GST-pulldown和Co-IP實驗證實了Nmi與UL23在體內存在相互作用并且進一步確定了Nmi與UL23相互作用的區(qū)域。免疫共沉淀實驗結果表明，缺失11個氨基酸的融合蛋白Myc-Nmi_Δ192aa-202aa不會與融合蛋白UL23-Flag相互作用，而缺失5個氨基酸的融合蛋白Myc-Nmi_Δ197aa-201aa和缺失6個氨基酸的融合蛋白Myc-Nmi_Δ192aa-197aa均能與UL23-Flag發(fā)生相互作用，猜測是因為Nmi上192～202aa中有某幾個間隔的氨基酸聯(lián)合作用于UL23，也可能是該區(qū)域具有特殊的空間構象有助于Nmi與UL23結合。

Figure 4. Verification of Nmi deletion mutants in interaction with UL23 by Co-IP assay. HeLa cells were transfected with Flag-tagged UL23 and indicated by Myc-tagged plasmids. The cell lysates were immunoprecipitated with anti-Flag. Immunoprecipitates were analyzed by immunoblot with anti-Myc or anti-Flag.

圖4免疫共沉淀方法驗證缺失突變型Nmi與UL23相互作用

Figure 5. Schematic diagram of Nmi domains that mediate the interaction with UL23.

圖5Nmi與UL23相互作用位點示意圖

Nmi 可以增強干擾素α啟動子的活性，抑制水皰性口炎病毒的生長[11]。Nmi與干擾素信號通路核心分子STAT家族中的STAT1和STAT5結合，從而促進STAT1與CBP/p300的相互作用，放大干擾素信號通路的生物學效應，使得抗病毒蛋白生成[12]。由于Nmi在抗病毒過程中發(fā)揮著重要角色，病毒通過干擾Nmi的功能抵抗宿主的免疫反應來促進病毒自身的增殖。Nmi增強干擾素信號通路中干擾素刺激應答元件IRSE啟動子的轉錄活性，而諾如病毒編碼的小分子RNA tth8能減少Nmi的表達，并減弱ISRE啟動子的轉錄活性[13]。Nmi與泡沫病毒的反式激活因子Tas相互作用后，阻礙Tas進入細胞核，干擾Tas的激活功能，從而抑制泡沫病毒的復制[14]。Nmi與UL23相互作用的區(qū)域位于Nmi上 NID2這個區(qū)域，而Nmi與Tip60相互作用區(qū)域與其部分重疊，位于Nmi上126～197aa區(qū)域。Nmi與Tip60相互作用后可以增強自身的穩(wěn)定性，但Nmi是否可以通過與UL23相互作用來促進自身的降解或者提高UL23的穩(wěn)定性，從而幫助病毒達到免疫逃避的目的有待進一步的研究。

蛋白相互作用缺失或者蛋白發(fā)生不恰當?shù)南嗷プ饔枚既菀讓е录毎驒C體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，細胞或機體生命活動受影響，從而引起疾病的發(fā)生甚至危害生命。UL23能與Nmi發(fā)生相互作用，前期實驗結果也表明，UL23能與多個宿主蛋白相互作用[6-7]，猜測HCMV可能利用UL23干擾宿主的生命活動，達到免疫逃避的目的。Nmi在細胞中主要定位在細胞核，而在穩(wěn)定表達UL23的細胞系中，Nmi與UL23主要定位于細胞質，Nmi和UL23相互作用后改變了Nmi的核定位。感染HCMV病毒后，Nmi通過與UL23相互作用抑制Nmi與STAT1的相互作用，阻止STAT1進入細胞核[8]。STAT1經過磷酸化后形成同源二聚體，進入細胞核與GAS啟動子結合，起始抗病毒基因的轉錄[15]。UL23可能通過與Nmi相互作用抑制STAT1入核，使STAT1參與的JAK-STAT信號通路受到影響，相應的抗病毒基因的轉錄被抑制，這有利于HCMV進行免疫逃避。本研究確認了Nmi與UL23的相互作用并且找到Nmi與UL23相互作用的關鍵氨基酸為Nmi上第192～202位氨基酸，這為闡明UL23幫助HCMV在宿主體內潛伏的分子機理提供了基礎，加深了我們對兩者相互作用的認識，為研究HCMV感染宿主的致病機理提供理論基礎。