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Rubler等[1]于1972年發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種與糖尿病病人體內(nèi)代謝紊亂有關(guān)的獨(dú)特心肌病變，不伴有高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心臟瓣膜病等心臟疾病。包括心肌細(xì)胞代謝紊亂、微血管病變引起的心臟病變。近年來(lái)研究表明，DCM對(duì)人類健康的威脅日益嚴(yán)重，是引起糖尿病病人死亡的重要合并癥之一，病人生活質(zhì)量也受到嚴(yán)重影響，因此，早期治療對(duì)降低DCM病人死亡率有重要意義[2]。本研究觀察鉀離子通道開放劑尼可地爾對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡的影響，為糖尿病心肌病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 40只雄性健康SD大鼠，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0004，體質(zhì)量150 g～170 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥物及試劑 尼可地爾購(gòu)自中外制藥株式會(huì)社、格列本脲購(gòu)自天津太平洋制藥有限公司，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、HE染色試劑盒、核酸末端標(biāo)記法(TUNEL法)試劑盒、天狼星紅染色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 Olympus BX53光學(xué)顯微鏡；羅氏全自動(dòng)生化分析儀Cobas 8000 c702。

1.4 糖尿病心肌病大鼠模型的建立， 以健康的SD雄性大鼠8只作為正常對(duì)照組(A組)，另取健康的SD雄性大鼠32只作為實(shí)驗(yàn)組，將實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為4組：糖尿病心肌病模型組(B組)、尼可地爾干預(yù)組(C組)、格列本脲干預(yù)組(D組)、尼可地爾+格列本脲干預(yù)組(E組)，每組8只。A組給予普通飼料喂養(yǎng)6周，B組、C組、D組、E組大鼠均予高脂高糖飼料(10%豬油、蔗糖20%、2%膽固醇、1%膽鹽、67%普通飼料)喂養(yǎng)6周后，給予腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol/L pH4.2的枸櫞酸緩沖液中，3 d后，禁食12 h，觀察大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食且尾靜脈取血測(cè)血糖值>16.7 mmol/L者成模[3-5]。繼續(xù)喂養(yǎng)，第8周開始，實(shí)驗(yàn)組分別予不同的干預(yù)，B組干預(yù)措施為連續(xù)28 d 生理鹽水4 mL/kg灌胃1次/日，C組為連續(xù)28 d尼可地爾 10 mg/kg灌胃1次/日，D組為連續(xù)28 d格列本脲 5 mg/kg灌胃1次/日， E組為連續(xù)28 d尼可地爾10 mg/kg 1次/日+格列本脲5 mg/kg灌胃1次/日。

1.5 制備組織標(biāo)本及觀察生化指標(biāo) 12周后，每組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，心臟取血用于化驗(yàn)各項(xiàng)生化指標(biāo)。用生理鹽水反復(fù)沖洗迅速取出完整新鮮心臟，濾紙吸干，稱重，分離左心室，浸入甲醛中，24 h后石蠟包埋。用HE染色法觀察心肌組織學(xué)變化及纖維化程度，TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、天狼星紅染色法觀察Ⅰ型/Ⅳ型膠原蛋白比例。羅氏全自動(dòng)生化分析儀Cobas 8000 c702測(cè)定血糖、血脂水平，包括空腹血糖(FBG)、 總膽固醇(TG)、三酰甘油(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。采用己糖激酶法測(cè)定血糖情況，采用常規(guī)酶法測(cè)定TG和TC，采用直接法測(cè)定HDL-C 和 LDL-C。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 對(duì)照組大鼠飲食、飲水量正常，尿量正常，毛色鮮亮，精神尚佳，情緒穩(wěn)定，反應(yīng)靈敏；實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)不同程度的多食、多飲、多尿，且有毛色枯黃、體形消瘦、煩躁、嗜睡的癥狀。

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)結(jié)果比較(見表1)

mmol/L

2.3 HE染色觀察心肌纖維化程度 A組可見心肌纖維走行正常，心肌細(xì)胞呈規(guī)整排列，核居細(xì)胞中央，呈完整的圓形或橢圓形，胞漿均勻著色，間質(zhì)及微血管也未見異常；B組、C組、D組、E組心肌纖維走行紊亂，可見壞死、斷裂的心肌纖維，核裂解及核溶解也有不同程度地出現(xiàn)，心肌細(xì)胞呈空泡狀，界限不清，同時(shí)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維細(xì)胞增生。其中 B組最為明顯，C組較其他各組纖維細(xì)胞增生程度最不明顯。詳見圖1。

圖1 HE染色后心肌纖維化程度(HE×200)

2.4 TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 正常心肌細(xì)胞核在光鏡下為藍(lán)色，形態(tài)、大小較為一致；而凋亡的心肌細(xì)胞核可見核濃縮、聚集，為黃褐色，著色深淺不一，大小不一。各組間心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2、表2。

組別n凋亡指數(shù)A組80．89±0．01B組80．92±0．03C組80．92±0．01D組80．93±0．01E組80．97±0．00

圖2 TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

2.5 天狼星紅染色法觀察Ⅰ型/Ⅳ型膠原蛋白比例 光鏡下可見Ⅰ型膠原纖維呈亮紅色，Ⅳ型膠原纖維呈綠色。對(duì)照組大鼠有較均勻、纖細(xì)的膠原纖維分布，還可見大部分變窄的心肌細(xì)胞束間隙。實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌橫切面，可見膠原纖維粗大、紊亂，排列成網(wǎng)。而尼可地爾干預(yù)組膠原纖維較其余模型組分布均勻。詳見圖3。

圖3 天狼星紅染色法觀察Ⅰ型/Ⅳ型膠原蛋白比例

3 討 論

糖尿病心肌病是一種與冠心病、瓣膜病無(wú)關(guān)的、獨(dú)立的特異性心肌病變。近年來(lái)研究表明，糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制包括多個(gè)非常復(fù)雜的方面，如心肌細(xì)胞代謝障礙、心肌微血管病變、胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)異常、細(xì)胞因子異常、氧自由基異常等[6]。目前大多數(shù)研究結(jié)果表明，早期DCM主要由以下幾方面引起，包括：心肌能量代謝紊亂、高血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡、線粒體損傷等[7-8]。文獻(xiàn)報(bào)道，DCM會(huì)發(fā)生一些病理改變，如心肌肥大、微血管變窄、膠原結(jié)構(gòu)改變、心肌纖維化[9]及心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，B組、C組、D組、E組與正常對(duì)照組(A組)相比，心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的病理組織學(xué)改變。

本研究先以高脂高糖飲食喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組大鼠，造成其糖脂代謝異常，再給予大鼠腹腔注射STZ，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，F(xiàn)BG、 TG、TC、LDL-C均偏高，表明實(shí)驗(yàn)組大鼠符合2型糖尿病特點(diǎn)，有胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂；而機(jī)體高血糖狀態(tài)可使心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶的活性受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+蓄積[10]，出現(xiàn)舒張功能障礙。而KATP通道可被尼可地爾激活，使K+導(dǎo)電性增強(qiáng)，從而K+外流增多，膜電位超極化，導(dǎo)致電壓依賴性Ca2+通道的關(guān)閉，減少Ca2+的內(nèi)流，使Na+-Ca2+交換增加，降低了心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[11]，起到了心肌保護(hù)作用。

尼可地爾是分子式中含有硝酸基的ATP敏感的KATP開放劑。它一方面通過(guò)直接激活cGMP，使得細(xì)胞膜和線粒體膜KATP的開放增加，具有舒血管的效應(yīng)，從而增加狀動(dòng)冠脈血流，改善血管痙攣和微循環(huán)；另一方面還可以使鉀離子存留到線粒體內(nèi)，抑制了鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯降低，進(jìn)而起到舒張血管、改善冠狀動(dòng)脈血流的功效，很大程度上減輕了心臟前后負(fù)荷[12-16]，同時(shí)在抗心肌細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)缺血預(yù)適應(yīng)方面，尼可地爾也有一定作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：尼可地爾干預(yù)組天狼星紅染色法觀察可見膠原纖維分布均勻，HE染色法可見心肌纖維化程度較糖尿病心肌病模型組輕，表明尼可地爾具有減輕糖尿病大鼠的心肌損傷作用。本研究中尼可地爾組與其他各組相比，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)之間的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析可能的原因有：①用于實(shí)驗(yàn)的樣本量不夠大，故有待觀察較大樣本量的細(xì)胞凋亡指數(shù)。②與尼可地爾的劑量較小有關(guān)，抗心肌細(xì)胞凋亡效果不顯著。③實(shí)驗(yàn)后期大鼠老齡化，心肌細(xì)胞本身也發(fā)生了凋亡。

本研究表明，尼可地爾可減輕糖尿病大鼠的心肌損傷及心肌纖維化，可為早期糖尿病心肌病的心肌保護(hù)提供依據(jù)，有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。