刁桂萍，楊 帥，遇文婧

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040； 2.黑龍江省林科院森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040)

植物致病真菌的細胞壁主要由幾丁質(zhì)、β-1,3-葡聚糖、α-1,3-葡聚糖和α-1,4-葡聚糖組成[1-3]。葡聚糖酶具有分解植物病原真菌細胞壁的能力，因此能夠起到抑制植物真菌的作用[4-6]。Cuddihy等[7]從番茄(Lycopersiconesculentum)的代謝產(chǎn)物中分離純化到一種葡聚糖酶，體外抑菌試驗表明，其能抑制番茄病原真菌茄鏈格孢菌(Altemariasolani)的菌絲生長。而在豌豆(Pisumsativum)種子中發(fā)現(xiàn)分子量為26 kDa的葡聚糖酶，能抑制菜豆炭疽菌(Colletotrichumlindemuthianum)和香蕉炭疽菌(Gloeosporiummusarum)菌絲的生長[8]。此外，大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)能誘導(dǎo)大豆葡聚糖酶活性的增強已被證實，而且大豆(Glycinemax)對大豆疫霉根腐病(P.sojae)的抗性與葡聚糖酶的活性呈正相關(guān)關(guān)系[9]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株棘孢木霉(T.asperellum)ACCC30536，由中國農(nóng)業(yè)微生物保藏管理中心(ACCC)提供。

1.2 葡聚糖酶基因Glu1的克隆及序列分析

利用Trizol法提取棘孢木霉ACCC30536的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)引物g1：5′-ATGACGATCCGCATCCTCGTC-3′和g2：3′-GGTGGAGGATGTTTCTATATC-5′進行cDNA的PCR擴增，擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中，經(jīng)過PCR檢測后進行測序[15]。對獲得的cDNA序列進行生物信息學(xué)分析：NCBI Conserved Domains search(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行保守區(qū)和蛋白家族預(yù)測，并尋找相似序列；MEGA5.1軟件進行多序列比對和進化樹的建立；ExPASy ProtParam(http:∥www.expasy.org/)分析分子量、等電點和疏水性；SignalP 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽；ProtComp 9.0進行亞細胞定位分析；Swissmodel(https:∥www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白的三維結(jié)構(gòu)，模式選自動建模[16-17]。

1.3 葡聚糖酶基因Glu1在不同培養(yǎng)條件下表達分析

將棘孢木霉ACCC30536菌絲體分別培養(yǎng)在MM[0.5%葡萄糖，15 g·L-1NaH2PO4，5 g·L-1(NH4)2SO4，600 mg·L-1CaCl22H2O，600 mg·L-1MgSO47H2O，5 mg·L-1FeSO4，2 mg·L-1CoCl2，1.6 mg·L-1MnSO4，1.4 mg·L-1ZnSO4]、C饑餓(MM-葡萄糖)，N饑餓(MM-(NH4)2SO4)，羧甲基纖維素鈉(M-葡萄糖+羧甲基纖維素鈉)，山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.pyramidlis)根粉(MM+1%山新楊根磨粉)，山新楊莖粉(MM+1%山新楊莖磨粉)，山新楊葉粉(MM+1%山新楊葉磨粉)，病原菌細胞壁(MM+1%楊樹爛皮病細胞壁)和病原菌發(fā)酵液(MM+5%楊樹爛皮病發(fā)酵液)[17]共9種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別在誘導(dǎo)0、12、24、48和72 h收取菌絲，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行qRT-PCR，每組重復(fù)3次。qRT-PCR反應(yīng)體系：10 μL的2×SYBR Green Real-time PCR Master mix，0.5 μL引物，2 μL的cDNA，ddH2O定量至總體積20 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s；82 ℃，讀板1 s；45個循環(huán)；55～95 ℃，每間隔0.5 ℃讀板1 s。并采用2-ΔΔCT方法計算基因表達量[17]。Glu1基因及內(nèi)參基因(Actin，α-tubulin和β-tubulin)引物如表1所列。

1.4 葡聚糖酶基因Glu1原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)Glu1基因序列和原核表達載體序列設(shè)計帶有酶切位點的引物，G1e:5′-ATCGGGATCCATGACGATCCGCATCCTCGTC-3′(下劃線為BamHI酶切位點)G2e:5′-CGATGCGGCCGCGGTGGAG-GATGTTTCTATATC-3′(下劃線為NotI酶切位點)。以棘孢木霉ACCC30536的cDNA為模板，G1e和G2e為引物進行PCR擴增。用BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶對PCR的回收產(chǎn)物及pGEX-4T-2質(zhì)粒分別進行雙酶切，用T4 DNA Ligase進行連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，在含終濃度為50 mg·L-1羧芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中篩選，并對獲得的轉(zhuǎn)化子進行PCR和雙酶切檢測[18]。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers

1.5 葡聚糖酶基因Glu1的原核表達

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株BL21中。將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子接種于3 mL含50 mg·L-1羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h。次日用新鮮培養(yǎng)基稀釋過夜的菌液，待菌液OD600為0.4～0.6時，加入終濃度為1.0 mmol·L-1IPTG，于30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)6 h，進行重組蛋白誘導(dǎo)表達，以IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-4T-2空載的大腸肝菌BL21及未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21作為對照，并通過電轉(zhuǎn)化進行蛋白純化[15]。

1.6 重組葡聚糖酶的酶活特性分析

采用還原糖測定法[19]，測定不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0)及不同反應(yīng)溫度(30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃)對重組葡聚糖酶酶活的影響。然后在最適溫度和pH條件下測定不同誘導(dǎo)時間(1、2、3、4、5和6 h)對重組葡聚糖酶活性的影響。以沸水浴中失活的粗酶液作對照，每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1的克隆與序列分析

棘孢木霉Glu1基因的cDNA序列全長為984 bp，編碼327個氨基酸(圖1)。ProtParam軟件分析表明，該葡聚糖酶的分子由4 956個原子構(gòu)成，分子式為C1592H2456N406Q494S8，相對分子量為35 443.92，等電點為4.76，含有20種氨基酸(表2)。通過BlastP預(yù)測該蛋白屬于Glyco-hydro-12家族(圖2A)。葡聚糖酶Glu1具有多個磷酸化位點，其中有18個蘇氨酸磷酸化作用位點(Thr：18)、13個絲氨酸磷酸化作用位點(Ser：13)和5個酪氨酸磷酸化作用位點(Tyr：5)，說明該葡聚糖酶磷酸化以蘇氨酸和絲氨酸磷酸化為主，兼有酪氨酸磷酸化(圖2B)。在葡聚糖酶Glu1第22和23個氨基酸中間有一個信號肽酶剪切位點LGI∥LF存在，第35和36個氨基酸中間有一個信號肽酶剪切位點TGO∥PP存在(圖2C)。棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶的三級結(jié)構(gòu)與模板β-1,4-葡聚糖酶(4h7m.1)的結(jié)構(gòu)有36%的相似性(大于30%可以期望得到較好的預(yù)測結(jié)果)，由此推測，棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶屬于β-1,4-葡聚糖酶(圖2D)。

2.2 棘孢木霉葡聚糖酶Glu1多序列比對及進化樹分析

通過Blastp獲得Glu1相似的氨基酸序列，從中選取相似性較高的13個序列進行分析(圖3)，其中深綠木霉IMI 206040(XP_013940397.1，相似度91%)、貴州木霉(OPB37643.1，相似度82%)、綠色木霉Gv29-8(XP_013954335.1，相似度81%)和里氏木霉QM6a(XP_006964596.1，相似度79%)的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶相似度最高。將Glu1和13個相似序列進行進化樹分析(圖4)，結(jié)果表明Glu1和13個相似序列被分成5組，其中Glu1和所有木霉屬的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶分成一組(Group 1)，其中Glu1和深綠木霉IMI 206040(XP_013940397.1)的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶同源性最高，親緣關(guān)系最近，而其他屬的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶被分為4組(Group 2、Group 3、Group 4和Group 5)。

表2 Glu1基因的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of Glu1

1ATGACGATCCGCATCCTCGTCAACGCTGCGCTGCTGGCCATCCCCATCGCCGTGACGCTGMTIRILVNAALLAIPIAVTL61GGCATCTTGTTCGGCCTCCAATCGCACCGAGATGCCACGGGCCAGCCGCCTTTGTTTGCGGILFGLQSHRDATGQPPLFA121CCTCAACCGCCGCCGATTCCAACTCCTGCACCGCCGAAACCCCCAAAGAATGGCGTCACCPQPPPIPTPAPPKPPKNGVT181AAGACGAGATATTGCCAAAAGTCGTATGGAATTACACCAGATACCACTGGGCAGCAGTATKTRYCQKSYGITPDTTGQQY241ATATTAAATCCTAATCAATGGAACTGGAACGTCGGCGATCCTGGACGCCTGTGTATGAATILNPNQWNWNVGDPGRLCMN301GTCACCACGTTTAACAACGGCACATATGCCACAAGCACTACCGCTCCTCAGTTTATGGTTVTTFNNGTYATSTTAPQFMV361TCATGGCAATATCCCCGTGGCCCAGAGGACAACCCTGTACACGCTTTCCCCAACATCCAGSWQYPRGPEDNPVHAFPNIQ421ATTGATACCGACGTCATTCCCGCCACTGTGAACAGCATTTCCAAAGTCGACATCGACATCIDTDVIPATVNSISKVDIDI481GAATGGTCCTACGGCGTCGGCAATGAGACCACAACGTCTTCTACCCTCGCGGATCTTACTEWSYGVGNETTTSSTLADLT541GCCGACAATCTCAACACCAACGTTGCTGTCGATATGTTTATTGACAGCGATAAGACGGCCADNLNTNVAVDMFIDSDKTA601GCTCAGAACCCTGCCAAGGCCAAGTTCGAACTCATGGTTTGGTTTGCGGCCTATGGTAGTAQNPAKAKFELMVWFAAYGS661TCCACTCAGCCCATCGGTTTTAGCAACGGTGCTGTGTCCACCCAAACGCTTAATGGCAACSTQPIGFSNGAVSTQTLNGN721ACATTCAATCTTTATGCTGGCATTAACACAGCGACCAAGCAAAACGTCATGACCTGGTACTFNLYAGINTATKQNVMTWY781ACCGACACGCCTATACAAAAGTTCAATGGAGACATATCTCCACTCATCAACAGCGTGTTCTDTPIQKFNGDISPLINSVF841AAGCTCACCACTGTTACCGATATTCCCAAGTCTAGCGACTACTTGGGATACCTGGCTCTGKLTTVTDIPKSSDYLGYLAL901GGCTCCGAGGCCTTTTCCGTTGACAAGACCGTCACGCTTTACGTACCCCAACTCTCGATAGSEAFSVDKTVTLYVPQLSI961GATATAGAAACATCCTCCACCTAG*DIETSST

圖1Glu1基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.1cDNAsequenceoftheGlu1geneandpredictedaminoacidsequenceoftheGlu1protein

粗體表示cDNA序列；斜體表示cDNA編碼的氨基酸序列。

Bold text indicates the cDNA sequence; italic text indicates the amino acid sequence encoded by the cDNA.

圖2 葡聚糖酶Glu1的保守區(qū)、磷酸化位點、信號肽及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 2 Image of the conserved region, phosphorylation site, signal peptide site, and tertiary structure of the predicted Glu1 sequence

A：Glu1的保守區(qū)；B：Glu1的磷酸化位點；C：Glu1的信號肽；D：Glu1的三級結(jié)構(gòu)。

A: conserved region of Glu1; B: phosphorylation site of Glu1; C: signal peptide site of Glu1; D: tertiary structure of Glu1.

2.3 棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1在9種誘導(dǎo)條件下的表達分析

運用qRT-PCR技術(shù)檢測9種誘導(dǎo)條件下棘孢木霉Glu1基因的調(diào)控表達水平(圖5)。在MM(圖5A)、N饑餓(圖5C)、1%山新楊根粉(圖5E)、1%山新楊莖粉(圖5F)、1%山新楊葉粉(圖5G)、1%楊樹爛皮病菌細胞壁(圖5H)和5%楊樹爛皮病菌發(fā)酵液(圖5I)培養(yǎng)條件下，Glu1基因均呈上調(diào)表達，分別在12、24、24、12、12、24和48 h達到峰值，分別為未誘導(dǎo)時的12.13(23.6)、13.93(23.8)、45.25(25.5)、10.56(23.4)、8.57(23.1)、6.06(22.6)和8.57(23.1)倍。但是，在C饑餓(圖5B)和羧甲基纖維素鈉(圖5D)培養(yǎng)條件下，Glu1基因呈下調(diào)表達，分別在24和12 h下調(diào)至最低點，分別低于未誘導(dǎo)時的6.96(22.8)和21.11(24.4)倍。說明Glu1基因在棘孢木霉響應(yīng)環(huán)境壓力中起到重要作用，并且能夠參與棘孢木霉對楊樹(Populus)或楊樹病原菌的識別。

2.4 棘孢木霉葡聚糖酶Glu1的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖6)顯示，重組轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，泳道1-5清晰可見蛋白條帶，大小與61.44 kDa的預(yù)測蛋白一致，而對照泳道6在相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn)，證明Glu1基因成功整合到大腸桿菌BL21中；而且誘導(dǎo)6 h的重組蛋白明顯多于誘導(dǎo)2和4 h的重組蛋白，說明IPTG誘導(dǎo)時間越長，轉(zhuǎn)化子分泌的蛋白越多。對變性復(fù)性后的蛋白進行電純化后，獲得純化后的目的蛋白rGlu1。

圖3 葡聚糖酶Glu1及其相似序列的多序列比對Fig. 3 Multiple sequence alignment of Glu1 and the similar sequences

*表示同源identity；XP_013940397.1: 深綠木霉T.atrovirideIMI 206040; OPB37643.1：貴州木霉T.guizhouense; XP_013954335.1：綠色木霉T.virensGv29-8; XP_006964596.1：里氏木霉T.reeseiQM6a; XP_006964596.1：里氏木霉T.reeseiQM6a; EQL01618.1：冬蟲夏草OphiocordycepssinensisCO18; KIM99495.1：大孢樹粉孢菌OidiodendronmaiusZn; KJK64291.1：寄生曲霉AspergillusparasiticusSU-1; XP_007817188.1：羅伯茨綠僵菌MetarhiziumrobertsiiARSEF 23; XP_014543006.1：羅伯茨綠僵菌MetarhiziumbrunneumARSEF; XP_014572972.1：大孢綠僵菌MetarhiziummajusARSEF 297; KDB11778.1：稻曲病菌Ustilaginoideavirens; KXG45790.1：灰黃霉Penicilliumgriseofulvum。

2.5 重組葡聚糖酶rGlu1酶活特性

首先測定不同濃度葡萄糖的吸光度繪制標準曲線，獲得線性回歸方程y=0.000 8x-0.003 9，R2=0.973 2。根據(jù)回歸方程，分析在不同pH、不同反應(yīng)溫度和不同反應(yīng)時間下rGlu1的酶活特性。在不同pH條件下，rGlu1活性呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)pH為4.5時，rGlu1活性最大，為1.81 U·mL-1(圖7A)；在不同反應(yīng)溫度條件下，rGlu1活性也呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)溫度達到45 ℃時，rGlu1活性最大，為1.86 U·mL-1(圖7B)；在不同反應(yīng)時間條件下，rGlu1活性呈遞增的趨勢，在5 h達到峰值，為1.80 U·mL-1，之后趨于平緩(圖7C)。這些結(jié)果表明，重組葡聚糖酶最適pH為4.5，偏酸性，最適溫度為45 ℃，且隨著時間的增加，重組酶活性逐漸增加，并于5 h后趨于平穩(wěn)。

圖4 葡聚糖酶Glu1及其相似序列的進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Glu1 and the similar sequences

所有分支顯示了可靠的置信度(超過50%的引導(dǎo)值)；線段上的數(shù)字表示堿基替換率。

All branches show significant support (>50% bootstrap values); the numbers on the line segments indicate the base replacement rates.

圖5 9種誘導(dǎo)條件下Glu1基因差異表達Fig. 5 Expression level of the gene Glu1 under nine different induction conditions

圖6 重組蛋白的SDS-PAGE檢測Fig. 6 SDS-PAGE detection of recombinant protein

M：Protein marker；1-5：IPTG分別誘導(dǎo)2、3、4、5和6 h，重組轉(zhuǎn)化子BL21-Glu1蛋白SDS-PAGE電泳圖；6：IPTG誘導(dǎo)6 h，對照轉(zhuǎn)化子BL21-BL21-pGEXSDS-PAGE電泳圖；7：純化后的重組蛋白rGlu1 SDS-PAGE電泳圖。

M: Protein Marker; 1-5: SDS-PAGE analysis of the transformant BL21-Glu1 induced for 2, 3, 4, 5, and 6 h, respectively; 6: SDS-PAGE analysis of the control transformant BL21-pGEX induced for 6 h; 7: SDS-PAGE analysis of purified recombinant rGlu1.

圖7 重組葡聚糖酶rGlu1酶活特性Fig. 7 Enzyme activity properties of recombinant rGlu1

3 討論與結(jié)論

木霉菌種類繁多，其分泌的代謝產(chǎn)物也相當(dāng)豐富，其中抗真菌次生代謝物和細胞壁水解酶協(xié)同作用可導(dǎo)致植物病原真菌死亡[20]。細胞壁水解酶中的葡聚糖能夠水解植物病原真菌細胞壁最外層覆蓋的葡聚糖層，使細胞壁骨架和細胞受損,而且抑菌試驗也表明葡聚糖酶對多種真菌菌絲的生長有抑制作用[21]。本研究從棘孢木霉ACCCC30536菌株基因組中克隆到一個葡聚糖酶基因Glu1，cDNA序列全長984 bp，由327個氨基酸組成，通過生物信息學(xué)分析推測此酶屬于β-1,4-葡聚糖酶。一些研究表明，β-1,4-葡聚糖酶在纖維素的水解過程中起著非常關(guān)鍵的作用，它能夠作用于纖維素鏈內(nèi)的β-1,4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子水解成更小分子量的葡萄糖聚合物[20,22]。插入β-1,4-葡聚糖酶的綠色木霉對小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)的抑制效果較原始木霉菌株明顯提高，抑制率提高了27%[21]。因此，本研究中的Glu1蛋白可能具有與β-1,4-葡聚糖酶一樣的生防特性。

在正常環(huán)境下葡聚糖酶在生物體中的含量較少，活性很低。當(dāng)生物體受到外界刺激時，葡聚糖酶可以被刺激物所誘導(dǎo)和積累[9]。研究表明，霍爾斯單軸霉(Plasmoparahalstedii)侵染后的向日葵(Helianthusannuus)，其葡聚糖酶基因表達量明顯升高[23]。在本研究中，當(dāng)棘孢木霉ACCC30536與山新楊及楊樹病原菌互作后，Glu1基因的表達也明顯上升，表明Glu1蛋白參與了生防菌棘孢木霉與楊樹及楊樹病原菌的識別，從而使楊樹(Populus)可能通過調(diào)節(jié)自身防御基因表達和生理變化來適應(yīng)環(huán)境或抵御病原真菌。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了Glu1基因的原核表達載體并獲得重組葡聚糖酶rGlu1。酶活特性分析表明，該重組rGlu1活性的最適pH為4.5，偏酸性，最適溫度為45 °C，與玉蜀黍赤霉菌(Gibberellazeae)的β-1,4-葡聚糖酶重組蛋白酶酶活特性報道結(jié)果一致[23]。此外，重組酶酶活受時間影響較大，隨著時間的增加，酶活也逐漸增加，并于5 h后趨于平穩(wěn)。 以上這些研究結(jié)果將為進一步探究葡聚糖酶的生防功能提供理論基礎(chǔ)，也為進一步開發(fā)和應(yīng)用葡聚糖酶類生物農(nóng)藥奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。