黃小玲 唐軼洋 鐘敏 趙高峰

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科（廣州 510006）

自噬是真核細(xì)胞所特有的通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分、清除衰老或受損細(xì)胞器的過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。目前普遍認(rèn)為自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制。研究表明心肌缺血再灌注損傷與自噬關(guān)系密切，自噬是缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞死亡的另一途徑［1］。2017年5-10月本研究采用H9c2大鼠心肌細(xì)胞作為受試細(xì)胞，檢測(cè)不同缺氧復(fù)氧損傷程度對(duì)自噬的影響，并觀察在此種自噬改變下對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響，從而摸索出當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下研究H9c2心肌細(xì)胞自噬的最佳缺氧復(fù)氧模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H9c2大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室；高糖型DMEM、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、PBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、丹酰戊二胺（MDC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)糖培養(yǎng)基購(gòu)自吉諾生物公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Mas?ter Mix購(gòu)自Toyobo公司；Atg5、GAPDH引物由廣州艾基生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備 H9c2心肌細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%雙抗（v/v）（100 U/mL青霉和100 mg/L鏈霉素）、高糖DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、95%空氣的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞融合度＞80%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（CON），細(xì)胞未作任何處理；缺氧復(fù)氧（H/R）模型3組，將H9c2心肌細(xì)胞置于37 ℃含 1%O2、5%CO2、94%N2缺氧培養(yǎng)箱中分別以 0.5%FBS 復(fù)合高糖 DMEM［2］、無(wú)糖培養(yǎng)基［3］、PBS［4］為缺氧液培養(yǎng)3 h模擬不同程度缺血缺氧，然后置換完全培養(yǎng)基置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h模擬復(fù)氧再灌注。收集復(fù)氧后H9c2心肌細(xì)胞或用于檢測(cè)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)H9c2細(xì)胞存活率 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基調(diào)成單細(xì)胞懸液，分配至96孔板，每孔約100 μL（2×104個(gè)/孔）。按上述方法進(jìn)行分組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔。按上述分組處理后，每孔加入MTT工作液（5 g/L）約10 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO終止反應(yīng)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，記錄并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。

1.2.3 MDC熒光染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9c2細(xì)胞自噬率 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基調(diào)成單細(xì)胞懸液，分配至24孔板，每孔約500 μL（1 × 105個(gè)/孔）。按上述方法進(jìn)行分組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按上述分組處理后吸除培養(yǎng)基，每孔加入MDC工作液（50 μmol/L）約500 μL，37℃避光孵育20 min，PBS洗3遍后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。由于MDC的激發(fā)光為355與染料DAPI相近，故使用DAPI模式檢測(cè)各組細(xì)胞群集中象限的熒光強(qiáng)度。記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算細(xì)胞自噬率：自噬率=實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Atg5 mRNA的表達(dá) 采用總RNA提取試劑盒按照試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)其濃度與純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，以cDNA為模板，SYBR Green摻入法進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。ATG5引物上游序列 5′?TGGACGGATTCCAACGTGCTTTAC?3′，下游序列 5′?TTTGTCAGTTACCAGCGTCAAATAGC?3′，內(nèi)參GAPDH引物上游序列5′?AGTGCCAGCCT?CGTCTCATA?3′，下游序列5′?ACCAGCTTCCCATT?CTCAGC?3′。反應(yīng)體系25 μL：含SYBR Green Master 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2.5 μL，ddH2O 9 μL。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件如下：95℃3 min、95 ℃ 15 s、58℃ 15 s、72℃ 15 s共39個(gè)循環(huán)。應(yīng)用Rio?Rad CFX Manager軟件分析每個(gè)孔Atg5及GAPDH的熒光強(qiáng)度并計(jì)算Atg5 mRNA表達(dá)的相對(duì)量。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用Stata 13統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H/R對(duì)H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響 與CON組相比，各H/R模型組細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05），其中0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基、PBS處理的各H/R組細(xì)胞存活率分別下降了15.2%、19.4%、25.9%。見圖1。對(duì)照組細(xì)胞存活率取100%。

2.2 各組H9c2心肌細(xì)胞自噬率的變化 如圖2A所示，取右下象限細(xì)胞群為陽(yáng)性象限細(xì)胞群（P1），根據(jù)各組熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與CON組相比各H/R模型組心肌細(xì)胞自噬率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基處理的H/R心肌細(xì)胞自噬率分別增加了26.2%、8.6%，PBS處理的則下降了17.5%。見圖2B。對(duì)照組細(xì)胞自噬率取100%。

圖1 MTT法檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞存活率Fig.1 The survival rate of H9c2 cardiomyocytes determined by MTT method

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞自噬率Fig.2 The autophagy rate of H9c2 cardiomyocytes determined by flow cytometer

2.3 Atg5 mRNA的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比各H/R模型組心肌細(xì)胞Atg5 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基處理的H/R心肌細(xì)胞Atg5 mRNA的表達(dá)分別增加了49%、10.5%，PBS處理的則下降了15.1%。見圖3。對(duì)照組細(xì)胞Atg5 mRNA的表達(dá)取100%。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞Atg5 mRNA的表達(dá)Fig.3 The mRNA expression levels of Atg5 analyzed by RT?PCR

3 討論

缺血性心臟病是心血管系統(tǒng)中發(fā)病率及病死率較高的疾病，臨床上多開展冠脈搭橋、冠狀動(dòng)脈介入術(shù)等進(jìn)行治療，但恢復(fù)冠脈血流灌注后，常引發(fā)H/R損傷［5］。因此，如何有效保護(hù)缺血心肌細(xì)胞，減輕H/R損傷是目前研究的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)自噬在一些嚴(yán)重的心臟病理狀況下，包括心肌梗死、缺血再灌注損傷及心力衰竭中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［6］，缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展及致死率與心肌細(xì)胞自噬的改變有很大的相關(guān)性［7］。自噬在心臟疾病中到底扮演著怎樣的角色，取決于細(xì)胞自噬發(fā)生的水平及病理狀態(tài)［8-10］。通過(guò)離體心臟研究發(fā)現(xiàn)自噬在缺血期處于較低水平，再灌注期則被高度激活，使用經(jīng)典的抑制劑3-MA后，自噬水平降低，再灌注后心肌梗死面積減少，提示心肌細(xì)胞自噬水平與心肌缺血再灌注損傷的程度呈正相關(guān)［11］。

研究表明，H9c2細(xì)胞株來(lái)自大鼠胚胎的心肌細(xì)胞，雖然不能搏動(dòng)，但因?yàn)榫哂信c原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞相似的功能與特性，且易于分離培養(yǎng)并可傳代，在H/R實(shí)驗(yàn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。故本研究選用H9c2大鼠心肌細(xì)胞株作為研究對(duì)象。體外心肌細(xì)胞H/R模型一直被廣泛應(yīng)用于H/R損傷的研究，對(duì)于探討H/R損傷的分子機(jī)制具有重要的意義。但國(guó)內(nèi)外利用缺氧箱建立H/R細(xì)胞模型的條件并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)查閱的文獻(xiàn)，目前構(gòu)建H/R損傷模型時(shí)常常采用斷氧及斷糖兩種方式，使用低血清或無(wú)血清缺氧液并置于缺氧箱中培養(yǎng)模擬心肌細(xì)胞缺血缺氧環(huán)境，通過(guò)恢復(fù)血清和氧的供應(yīng)模擬再灌注。對(duì)于缺氧培養(yǎng)時(shí)的氧濃度主張從無(wú)氧到5%各有不同［12-13］，缺氧復(fù)氧的時(shí)間和缺氧液也各有不同，常用的缺氧液有自配缺氧液［14］、無(wú)血清無(wú)糖培養(yǎng)液［3］、無(wú)糖Hanks液［15］等。本實(shí)驗(yàn)選用1%的氧濃度，分別以0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基和PBS為缺氧液缺氧3 h后復(fù)氧3 h來(lái)模擬H/R，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各缺氧液處理的H/R模型組心肌細(xì)胞存活率均低于正常對(duì)照組（P＜0.05），表明上述方法建立的離體細(xì)胞H/R損傷模型是可行的，利用缺氧培養(yǎng)箱可以造成H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷。

多數(shù)研究者認(rèn)為H/R發(fā)生的基礎(chǔ)是能量代謝障礙［16］。從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及能量供給方面考慮，0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM優(yōu)于無(wú)糖培養(yǎng)基，無(wú)糖培養(yǎng)基優(yōu)于PBS。本研究結(jié)果表明三者作為缺氧液H/R損傷后細(xì)胞存活率逐漸下降，說(shuō)明損傷的程度與其缺氧液物質(zhì)和能量供給的優(yōu)劣是相一致的；心肌細(xì)胞自噬率以及Atg5 mRNA的表達(dá)也逐漸下降，說(shuō)明細(xì)胞自噬的水平也有可能和物質(zhì)與能量的需求平衡相關(guān)。LUM等［17］研究認(rèn)為，各種原因引起的細(xì)胞內(nèi)ATP水平的下降均可誘發(fā)自噬，從而保證細(xì)胞能量代謝的穩(wěn)定，利于細(xì)胞生存，但是過(guò)于嚴(yán)重或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的“饑餓”狀態(tài)反而抑制自噬。本研究的結(jié)果與上述的研究結(jié)論是一致的。0.5%FBS復(fù)合高糖DMEM、無(wú)糖培養(yǎng)基處理的心肌細(xì)胞自噬率以及Atg5 mRNA的表達(dá)相對(duì)對(duì)照組是增加的，這表明以上兩種缺氧液H/R損傷后誘發(fā)自噬，且前者更明顯；而PBS處理的相對(duì)對(duì)照組則是下降的，表明PBS作為缺氧液H/R損傷后反而抑制自噬。這說(shuō)明H/R損傷心肌細(xì)胞自噬的水平可能與心肌缺氧的程度以及細(xì)胞的狀態(tài)呈相關(guān)性，但尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

綜上，利用缺氧培養(yǎng)箱可以造成H9c2大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞自噬的水平與心肌缺氧的程度以及細(xì)胞的狀態(tài)呈相關(guān)性。細(xì)胞適度缺氧復(fù)氧可以激活細(xì)胞自噬，但細(xì)胞過(guò)分缺氧反而抑制自噬。