吳菡 孫蘇安 劉海燕 劉文杰 黃建

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院病理科（江蘇淮安223300）

精準(zhǔn)醫(yī)療是目前醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)，檢測(cè)相關(guān)位點(diǎn)突變是實(shí)施分子靶向治療的關(guān)鍵，可為臨床治療方案的制定和藥物改進(jìn)提供重要的信息［1］。非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%～85%，其在基因組層面的多樣性和復(fù)雜性決定了治療和預(yù)防的難度較大，但也為肺癌分子靶向治療的研究提供了更多的方向和可能［2］。表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）信號(hào)通路在肺癌分子靶向治療中研究得較為集中且深入，而酪氨酸酶氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）則是根據(jù)EGFR異常表達(dá)調(diào)控而研制出的相應(yīng)的小分子藥物，并在臨床上收獲了顯著的治療效果［3］。RUSSO等［4］研究表明，EGFR?TKIs較放化療能顯著延長(zhǎng)NSCLC患者的無(wú)進(jìn)展生存期，且不良反應(yīng)較少，但仍存在次級(jí)突變（secondary mutation）以及耐藥性等問(wèn)題，靶向藥物還要根據(jù)基因研究的結(jié)果不斷改進(jìn)。

棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4?間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule?associated protein?like 4?anaplastic lymphoma kinase，EML4?ALK）融合基因被稱為驅(qū)動(dòng)程序突變，直接影響肺癌的發(fā)生和發(fā)展，是繼EGFR之后的又一個(gè)研究熱點(diǎn)［5］。CHRIS?TOPOULOS等［6］報(bào)道EML4?ALK融合基因陽(yáng)性表達(dá)比例較小，但仍是重要的癌癥驅(qū)動(dòng)基因，臨床上也針對(duì)存在ALK陽(yáng)性的局部晚期和轉(zhuǎn)移的NSCLC群體而研制出有效的抗腫瘤藥物克唑替尼，但EML4?ALK融合基因突變尚不能作為評(píng)價(jià)NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素。EGFR基因突變是肺癌靶向治療的研究熱點(diǎn)，EML4?ALK融合基因?yàn)楹Y選靶向藥物獲益人群提供依據(jù)，本研究檢測(cè)NSCLC患者EGFR基因突變與EML4?ALK融合基因表達(dá)情況，可為完善肺癌治療靶向分子突變類型提供更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2017年6月南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院NSCLC標(biāo)本213例，其中男119例，女94例；年齡25～87歲，中位年齡57歲；腺癌94例，非腺癌119例?；颊呔唇邮苓^(guò)放療、化療、免疫治療、EGFR?TKIs或ALK酪氨酸激酶抑制劑治療。本研究患者及其家屬知曉，獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 安捷倫Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)），樣本提取及EGFR、EML4?ALK檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司。

1.2.1 核酸提取 （1）確保組織切片中腫瘤細(xì)胞比例＞50%。（2）選取腫瘤細(xì)胞富集區(qū)，8 μm切片10張至1.5 mL EP管中，加入二甲苯1 mL，振蕩混勻10 s，14 000 r/min離心2 min，去上清，吸干EP管底部液體，重復(fù)上述步驟1次；加入1 mL無(wú)水乙醇，振蕩混勻10 s，14 000 r/min離心2 min，去上清，吸干EP管底部液體，重復(fù)上述1次；待乙醇充分揮發(fā)后，應(yīng)用AmoyDx?FFPE樣品分離試劑盒（離心柱型）提取DNA和RNA。

1.2.2 EGFR突變檢測(cè) 采用ARMS檢測(cè)EGFR基因突變狀態(tài)。樣品準(zhǔn)備：紫外分光光度儀檢測(cè)提取的DNA樣本濃度與質(zhì)量。DNA濃度稀釋至2 ng/μL，將 23.5 μL 已稀釋 DNA 樣品加入 1.5 μL Taq酶中混勻，依次取5 μL加入8連管PCR反應(yīng)體系中。設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照，安捷倫Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。循環(huán)條件為95℃、5 min為1個(gè)循環(huán)；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s共15個(gè)循環(huán)；93 ℃、25 s，60 ℃、35 s，72 ℃、20 s共31個(gè)循環(huán)。判讀兩種突變類型的陽(yáng)性范圍Ct值。

1.2.3 EML4?ALK融合基因檢測(cè) 采用RT?PCR分析EML4?ALK融合基因突變情況。（1）RT反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL、RNA 模板 6 μL（RNA 總量0.5～5.0 μg），42 ℃、1 h，95 ℃、5 min逆轉(zhuǎn)錄得到ALK cDNA。（2）PCR擴(kuò)增：ALK cDNA加入1.5 μL混合酶混勻，依次移取5 μL加入8連管PCR反應(yīng)體系中，設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)儀器及循環(huán)條件同EGFR突變檢測(cè)，同樣判讀Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用（n）或（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因、EML4?ALK融合基因突變與臨床病理特征的關(guān)系 在213例NSCLC患者中，EGFR基因突變率為25.35%，EML4?ALK融合基因表達(dá)率為2.82%。臨床病理特征方面，兩種基因突變均表現(xiàn)為女性高于男性、非吸煙者高于吸煙者、腺癌高于非腺癌、＜60歲高于≥60歲（僅EML4?ALK），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 EGFR基因突變、EML4?ALK融合基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between EGFR gene mutation，EML4?ALK fusion gene expression and clinicopathological characteristics

2.2 EGFR基因突變和EML4?ALK融合基因表達(dá)的特點(diǎn) 54例EGFR基因突變類型為19 del（n=26）和 L858R（n=20），雙重突變者共 4例。6例EML4?ALK融合基因突變類型均為EML4 exon13?ALK exon20（E13?A20）型V1突變。見(jiàn)表2。未發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在EGFR、EML4?ALK陽(yáng)性的病例。

表2 EGFR基因突變和EML4?ALK融合基因表達(dá)的特點(diǎn)Tab.2 Characteristics of EGFR gene mutation and EML4?ALK fusion gene

3 討論

分子靶向治療是腫瘤治療的未來(lái)，有研究［7］顯示，EFGR酪氨酸激酶區(qū)域的突變主要發(fā)生在18～21號(hào)外顯子，其中19和21號(hào)外顯子突變約占所有突變的90%，且在不吸煙者、女性、腺癌患者中的突變率較高，并具有一定的地域差異，如東亞人群的EGFR突變率要明顯高于其他地域。仇秦威等［8］研究中國(guó)華南地區(qū)172例非小細(xì)胞肺癌患者的EFGR突變情況，結(jié)果顯示EGFR突變率為32%（55/172），且熱點(diǎn)突變?yōu)?9號(hào)外顯子缺失和21號(hào)外顯子L858R突變；同時(shí)，發(fā)生EGFR突變也是在女性、無(wú)吸煙史和腺癌患者中比例較高。本研究中EGFR基因突變率為25.35%，其中以19號(hào)外顯子E19del和21號(hào)外顯子L858R突變?yōu)橹鳎?8.15%、37.03%），且仍以女性、非吸煙者和腺癌患者發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高，與上述研究結(jié)果相符。目前，EFGR突變率在女性、非吸煙、腺癌中較高的原因尚不明確，LEVY等［9］研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變率在黃種人群要高于白種人群和黑種人群，在腫瘤組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)中也較高。YU等［10］研究表明，與miR?155、miR?16及miR?133a比較，非吸煙女性肺腺癌（lung adenocarcinoma，ADC）組織中miR?25在EGFR野生型的患者中表達(dá)升高，可能提示患者預(yù)后不佳。王玉等［11］研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者miR?93?3p表達(dá)升高，miR?93?3p可能成為女性非吸煙肺腺癌靶向治療的新靶點(diǎn)。上述研究結(jié)果提示，遺傳因素、環(huán)境地域差異、生活習(xí)慣等均與EGFR突變有關(guān)，仍需進(jìn)一步的研究。

EML4?ALK融合基因是NSCLC的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，是在2007年由SODA等［12］首次從NSCLC腫瘤組織中擴(kuò)增出的，并已研制出ALK抑制劑——克唑替尼。目前，EML4?ALK突變率在NSCLC患者中并不高，LIU等［13］、ULIVI等［14］、張海燕等［15］報(bào)道的EML4?ALK突變率分別為8.7%（2/23）、8.4%（32/380）、7.6%（5/66），且均表現(xiàn)為女性、非吸煙、腺癌、年齡輕（≤59歲）具有更高的突變風(fēng)險(xiǎn)。本研究EML4?ALK融合基因表達(dá)率為2.82%（6/213），較上述研究結(jié)果低，考慮與本研究納入的213例患者中女性例數(shù)較少有關(guān)（94vs.119），但在檢出的6例陽(yáng)性患者中，仍表現(xiàn)為女性、非吸煙、腺癌、年齡輕（＜60歲）的突變特點(diǎn)，其原因可能為亞裔女性吸煙率較低、樣本量較少、納入標(biāo)準(zhǔn)及遺傳因素有關(guān)。FALLET等［16］認(rèn)為EML4?ALK融合基因突變更傾向于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的中晚期病例，本研究EML4?ALK融合基因突變與臨床分期無(wú)相關(guān)性，考慮為EML4?ALK融合基因突變樣本數(shù)量少、病理分期分布不均有關(guān)。

本研究6例EML4?ALK融合基因突變類型均為 V1突變（E13?A20），而鄭劍滔等［17］分析 9例EML4?ALK突變類型發(fā)現(xiàn)，其中雙位點(diǎn)突變3例，具體為亞型1突變9例，亞型3突變1例，亞型2突變2例，說(shuō)明亞型1是EML4?ALK融合基因最常見(jiàn)的突變類型。同時(shí)，其研究還發(fā)現(xiàn)了EML4?ALK突變（亞型1及亞型2突變）與EGFR突變（19號(hào)外顯子突變）并存的病例。王旭洲等［18］也發(fā)現(xiàn)了6例EML4?ALK與EGFR兩種驅(qū)動(dòng)基因的同時(shí)突變，并經(jīng)AMRS法和FISH法驗(yàn)證成立，說(shuō)明EML4?ALK融合基因與EGFR雙突變并非完全排斥，只是這種情況的發(fā)生概率較低。本研究未發(fā)現(xiàn)上述兩種驅(qū)動(dòng)基因突變的并存病例，考慮與樣本量較少、檢測(cè)方法較單一有關(guān)。

不足的是，首先，本研究并未對(duì)KRAS基因突變進(jìn)行檢測(cè)，而其突變會(huì)導(dǎo)致EGFR信號(hào)通路持續(xù)激活，加速腫瘤細(xì)胞增殖，影響EGFR?TKIs療效［19］；其次，本研究其他EGFR突變基因也有重要的研究?jī)r(jià)值，如20號(hào)外顯子T790M突變已被證實(shí)［20］是一種獲得性耐藥性的基因突變，其可導(dǎo)致第1、2代EGFR?TKIs藥物療效較差，同時(shí)也是第3代藥物要克服的問(wèn)題；再次，本研究設(shè)計(jì)也較為簡(jiǎn)單，納入樣本量較少，對(duì)于EML4?ALK融合基因的檢測(cè)方法也較為簡(jiǎn)單，因此可在研究對(duì)象篩選、檢測(cè)指標(biāo)選擇及檢測(cè)方法應(yīng)用等方面展開(kāi)研究；最后，EGFR基因突變的異質(zhì)性也會(huì)影響EGFR?TKIs療效，如李志陽(yáng)等［21］證實(shí)女性EGFR基因突變異質(zhì)性率顯著高于男性，而多發(fā)肺結(jié)節(jié)患者的腫瘤異質(zhì)性發(fā)生率最高，這對(duì)抗腫瘤治療具有很重要的意義，值得深入研究。

綜上所述，本研究證明NSCLC患者中EGFR基因突變最為常見(jiàn)，EML4?ALK融合基因陽(yáng)性表達(dá)較少，兩種基因均在女性、非吸煙和腺癌患者中表達(dá)較高。本研究雖未觀察到EML4?ALK融合基因伴EGFR基因突變的病例，但報(bào)告確有存在，而多靶點(diǎn)抑制劑能否使靶向治療人群獲益更大仍有待進(jìn)一步研究。