梁繼珍 蘇寧 謝亞琳 易基群

廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院腫瘤科（廣州 510220）；2廣州市胸科醫(yī)院腫瘤科（廣州510095）

肺癌是目前發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，75%的患者在診斷時(shí)就已經(jīng)是局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1］，其中腺癌是肺癌中最常見的亞型。在接受全身化療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，有80%的患者僅僅通過小活檢標(biāo)本或細(xì)胞學(xué)樣本明確診斷［2］。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)是肺癌分子診斷的重要組成部分，而其檢測(cè)方法眾多，目前在臨床應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法包括ARMS（amplification refractory mutation system）法和Sanger測(cè)序法［3-4］。理論上前者靈敏度及特異度均較高，但二者在臨床小樣本檢測(cè)中的差異未見相關(guān)報(bào)道。結(jié)合目前臨床晚期肺癌的病理標(biāo)本絕大多數(shù)為小組織樣本的現(xiàn)狀，有必要對(duì)二者檢測(cè)晚期肺腺癌小樣本EGFR基因突變的價(jià)值進(jìn)行比較。

本研究擬通過ARMS法和Sanger測(cè)序法對(duì)近3年晚期肺腺癌小標(biāo)本組織進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，回顧性分析2種檢測(cè)方法EGFR基因的各自分布，及其與臨床病理特征的關(guān)系，并對(duì)其二者的檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)行初步比較。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 篩選并回顧性收集廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院和廣州市胸科醫(yī)院2013年1月至2016年12月初診晚期肺腺癌病歷資料。收集的臨床病理資料包括年齡、性別、吸煙史、活檢部位、活檢方法、標(biāo)本性質(zhì)、原發(fā)腫瘤分期、淋巴結(jié)分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期、TNM分期。共收集到ARMS法檢測(cè)標(biāo)本102例、Sanger測(cè)序法檢測(cè)標(biāo)本138例，其中39例標(biāo)本進(jìn)行了上述2種方法的檢測(cè)。臨床分期根據(jù)IASLC 2009年制定的NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。吸煙史在患者初診時(shí)采集，分為：（1）非吸煙（吸煙≤ 100支）；（2）吸煙（吸煙＞100支）。所有患者已經(jīng)被告知并同意使用其標(biāo)本用于基因檢測(cè)。試驗(yàn)已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 本研究納入的小標(biāo)本通過以下方式獲?。海?）支氣管鏡活檢；（2）經(jīng)皮肺穿刺活檢；（3）經(jīng)皮胸膜穿刺活檢；（4）淺表淋巴結(jié)/皮下結(jié)節(jié)部分切取或完整切除標(biāo)本。組織活檢后經(jīng)10%福爾馬林固定并石蠟包埋后，切取4 μm載玻片用于病理分析及基因檢測(cè)。

1.3 EGFR基因檢測(cè) EGFR基因分別使用ARMS法和測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)。大致過程如下：（1）病理評(píng)估：2位病理科醫(yī)生分別核對(duì)石蠟組織的HE染色玻片，確保腫瘤組織比例＞50%，切取每片4 μm厚的切片10張用于后續(xù)檢測(cè)；（2）DNA提?。菏褂肈Neasy Blood and Tissue Kit（No.69504；Qiagen，Valencia，CA）提取腫瘤組織DNA；（3）EGFR檢測(cè)：ARMS法使用AmoyDx人類EGFR基因21種突變檢測(cè)試劑盒（No.ADx?EG01；廈門艾德）在Lightcycler 480（羅氏公司）儀器進(jìn)行；測(cè)序法使用4組引物對(duì)EGFR外顯子18-21進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Big Dye Terminator Version 3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒（Applied Biosystems）和 ABI3700 genetic analyzer（Applied Biosystems）進(jìn)行正向和反向測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，計(jì)量資料采用描述，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARMS法檢測(cè)EGFR結(jié)果及其與臨床病理特征的關(guān)系 ARMS法檢測(cè)102例樣本，EGFR突變占47例（46.1%）、野生型55例（53.9%），其中外顯子19 del突變26例（25.5%）、外顯子21 L858R突變17例（16.7%）、外顯子19 del、21 L858R雙突變及外顯子19 del、21 L861Q雙突變各1例（1.0%）、其他突變2例（2.0%）（圖1）。EGFR基因突變與各臨床病理特征之間的關(guān)系如表1所示。統(tǒng)計(jì)分析提示女性EGFR基因突變率高于男性（61.9%vs.35.0%，P=0.007），而非吸煙與吸煙EGFR基因突變未見顯著差異（52.5%vs.36.6%，P=0.115）。EGFR基因突變與年齡、活檢部位、活檢方法、標(biāo)本性質(zhì)、原發(fā)腫瘤、淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分期無關(guān)（P＞0.05）。

圖1 晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變（ARMS法，102例）Fig.1 EGFR mutation by ARMS method in small specimen of advanced lung adenocarcinoma（n=102）

2.2 Sanger測(cè)序法檢測(cè)EGFR結(jié)果及其與臨床病理特征的關(guān)系 138例樣本進(jìn)行測(cè)序法EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果如圖2。EGFR突變52例（37.7%），其中外顯子19 del突變22例（15.9%）、外顯子21 L858R突變19例（13.8%）、其他突變11例（8.0%）。不同活檢部位間的EGFR基因突變存在一定的差異（P=0.049），而EGFR基因突變與年齡、性別、吸煙狀態(tài)、活檢方法、標(biāo)本性質(zhì)、原發(fā)腫瘤、淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分期均無關(guān)（P＞0.05）（表2）。女性與男性、非吸煙與吸煙EGFR基因率突變分別為46.4%vs.31.7%（P=0.080）、40.3%vs.34.8%（P=0.511）。

2.3 ARMS法和Sanger測(cè)序法比較EGFR基因的一致性 39例標(biāo)本進(jìn)行了ARMS法和測(cè)序法2種方法檢測(cè)，EGFR基因突變的一致率為64.1%（25/39）（表3）。一致性分析提示兩種EGFR基因檢測(cè)方法的結(jié)果具有中等的一致性，Kappa系數(shù)等于0.499（P＜ 0.001）。

3 討論

NCCN指南推薦根據(jù)是否存在EGFR等驅(qū)動(dòng)基因事件指導(dǎo)晚期肺腺癌的一線治療，且不同EGFR突變類型間靶向藥物治療的療效也存在差異［5］，故準(zhǔn)確檢測(cè)肺腺癌患者EGFR基因突變，有助于晚期肺癌患者的個(gè)體化治療。EGFR基因突變與眾多因素有關(guān)，包括臨床因素、檢測(cè)方法、標(biāo)本因素和異質(zhì)性等［6］。

表1 ARMS法晚期肺腺癌EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by ARMS method and clinical pathologic features 例（%）

圖2 晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變（測(cè)序法，138例）Fig.2 EGFR mutation by sequencing method in small specimen of advanced lung adenocarcinoma（n=138）

Sanger測(cè)序法和ARMS法是EGFR基因檢測(cè)最經(jīng)典和最廣泛應(yīng)用的方法。前者能檢測(cè)到10%～20%及以上的EGFR突變細(xì)胞，而ARMS法可檢測(cè)出組織中0.1%～1%的突變體［3-4］。當(dāng)樣本中DNA難以達(dá)到分光光度法所能檢測(cè)的最低限度時(shí)，小劑量低比例的腫瘤衍生DNA常被測(cè)序法誤判為EGFR野生型［7］。有研究認(rèn)為測(cè)序法可能漏掉25%的突變陽性病例［8］。而有研究證實(shí)EGFR基因突變還存在量上的差異即高豐度和低豐度，二者使用靶向治療的療效也不存在差異［9］。

檢測(cè)樣本的選擇也是影響檢測(cè)的重要因素。理想的檢測(cè)樣本是新鮮腫瘤組織或冰凍腫瘤組織。而臨床診斷的腫瘤組織標(biāo)本通常經(jīng)由福爾馬林固定并包埋于石蠟中，此過程會(huì)破壞核酸的完整性，尤其是福爾馬林固定超過24 h或者蠟塊保存超過3年的組織［10］。另外，微創(chuàng)技術(shù)的應(yīng)用和醫(yī)學(xué)倫理的要求使得晚期肺癌的活檢樣本也越來越小。目前基因檢測(cè)所需的最少惡性腫瘤細(xì)胞數(shù)目尚無定論，推薦選擇至少含有200～400個(gè)腫瘤細(xì)胞的較大樣本進(jìn)行基因檢測(cè)［11］。隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，目前用于EGFR基因檢測(cè)的樣本日益多樣化，包括手術(shù)切除標(biāo)本、小活檢樣本、胸水樣本、外周血樣本等；有研究顯示使用ARMS法對(duì)惡性胸腔積液中EGFR基因檢測(cè)，其突變率為54.5%，低于組織樣本檢測(cè)［12］。

本研究分別使用ARMS法和測(cè)序法檢測(cè)102例和139例肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變，二者的EGFR突變率分別為46.1%和37.7%。臨床特征分析提示女性ARMS法EGFR基因突變陽性率顯著高于男性；在ARMS法不同吸煙狀況，測(cè)序法不同性別，測(cè)序法不同吸煙狀況之間EGFR突變雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍能看出在肺腺癌小標(biāo)本EGFR突變?cè)诓煌詣e及吸煙狀況間存在差異的趨勢(shì)。對(duì)比國(guó)內(nèi)研究，使用ARMS法檢測(cè)119例肺腺癌標(biāo)本，突變率為49.58%，在女性及不吸煙患者中突變率較高［13］。本研究的結(jié)果與其相似。標(biāo)本類型方面，本研究選擇了4種不同類型的小標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分析不同標(biāo)本類型、活檢方式的EGFR突變的差異。筆者注意到測(cè)序法不同活檢部位之間的EGFR突變陽性率達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.049），但此結(jié)果可能為樣本選擇誤差所致。通過39例完成測(cè)序法和ARMS法EGFR基因突變檢測(cè)樣本的比較，二者EGFR基因突變具有中等的一致性。需注意到3例胸膜活檢的樣本中存在2例（66.7%）的不一致，提示對(duì)于一些腫瘤細(xì)胞較少的樣本使用較敏感方法檢測(cè)的必要性。本研究由于是在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室使用不同的標(biāo)本、不同的檢測(cè)方法進(jìn)行的，產(chǎn)生上述差異的原因，還需考慮到腫瘤組織內(nèi)的異質(zhì)性［14］。

表2 Sanger測(cè)序法晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by sequencing method and clinical pathologic features 例（%）

表3 ARMS法與測(cè)序法晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變的一致性Tab.3 The consistency of EGFR mutation in advanced lung adenocarcinoma by ARMS method and sequencing method 例（%）

本研究進(jìn)一步提示臨床上采用ARMS法進(jìn)行小組織樣本進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)，可能進(jìn)一步提高EGFR突變檢測(cè)的檢出率，但EGFR突變敏感性和精確度的提高是否有助于臨床獲益有待進(jìn)一步分析?？傮w而言，肺腺癌小標(biāo)本組織通過ARMS法和測(cè)序法進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)具有一定的差異，參照測(cè)序法小組織樣本EGFR基因結(jié)果需謹(jǐn)慎進(jìn)行臨床決策。