□ 許月明 潘言方 李慧慧 蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院

硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動(dòng)力學(xué)的特性，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，并作為雞肉、禽類、水產(chǎn)和豬的促生長(zhǎng)添加劑使用。但在長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物和代謝物均可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變。鑒于此，硝基呋喃類藥物在1995年已經(jīng)在治療和飼料中禁用。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快被代謝，但其代謝產(chǎn)物在組織中則能存留較長(zhǎng)時(shí)間。因此管理部門(mén)在檢測(cè)硝基呋喃類藥物殘留時(shí)通常也分析此類藥物的代謝產(chǎn)物的含量。

ELISA可視化微陣列芯片檢測(cè)系統(tǒng)可對(duì)單個(gè)樣本中多個(gè)硝基呋喃類藥物代謝產(chǎn)物進(jìn)行同時(shí)定量檢測(cè)，并配套有相關(guān)檢測(cè)設(shè)備，可以使檢測(cè)效率比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的分析方法如LC、LCMS、LC-MS/MS、ELISA方法等更高效，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、檢測(cè)樣本量大、精確度和靈敏度好等特點(diǎn)，且自動(dòng)化程度高。

1 檢測(cè)原理

ELISA可視化微陣列芯片用于蜂蜜等樣品中抗生素殘留檢測(cè)是基于間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析原理。ELISA可視化微陣列芯片微孔中包含有識(shí)別多個(gè)硝基呋喃抗生素代謝物分子的人工抗原點(diǎn)，當(dāng)在微孔反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入待測(cè)抗生素樣品與相應(yīng)抗體后，游離的待測(cè)物和芯片上固定的人工抗原點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相應(yīng)的抗體。因此游離的待測(cè)物越多，抗體與固定在芯片上的相關(guān)抗原點(diǎn)的結(jié)合量就越少。待反應(yīng)完畢洗滌后，加入納米催化顯色試劑，納米顆粒經(jīng)催化反應(yīng)而直徑顯著增加，在芯片表面形成肉眼可見(jiàn)的黑色斑點(diǎn)。各黑色斑點(diǎn)通過(guò)芯片分析儀自動(dòng)掃描檢測(cè)后可獲得各斑點(diǎn)的相關(guān)灰度值。由于樣品中殘留的抗生素含量與樣品的灰度值呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)芯片分析軟件與標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)比較計(jì)算后，即可得出各相關(guān)硝基呋喃代謝物的含量，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)硝基呋喃代謝物的同時(shí)定量檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

芯片分析儀、均質(zhì)器、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管（10mL）、天平（感量 0.1g）、容量瓶（100mL）、洗板機(jī)、恒溫振蕩儀、玻璃試管10mL，聚苯乙烯離心管50mL、2mL。微量移液器：?jiǎn)蔚?0～200 μL，100～1000 μL，1000～5000 μL。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃鹽酸、三水合磷酸氫二鈉、去離子水，均為分析純。

2.3 溶液的配制

2.3.1 磷酸鹽緩沖液

稱取22.8g三水合磷酸氫二鈉，加入1 L去離子水溶解混勻。

2.3.2 1mol/L鹽酸溶液

移取8.3mL濃鹽酸（12mol/L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%），加入去離子水定容至100mL，混勻。

2.3.3 1mol/L氫氧化鈉溶液

稱取4.0g氫氧化鈉加入100mL去離子水溶解混勻。

2.3.4 洗滌工作液

用去離子水將20X濃縮洗滌液按1∶19體積比進(jìn)行稀釋（一份20X濃縮洗滌液+19份去離子水）用于芯片板的洗滌，洗滌工作液在4℃（39.2℉）環(huán)境可保存一個(gè)月。

2.4 ELISA可視化微陣列芯片組成（96T）

2.4.1 微量測(cè)試孔

每條8孔，一板12條。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)液6瓶

標(biāo)準(zhǔn)液0.5mL/瓶，包括AMOZ、AOZ、SEM、AHD的標(biāo)準(zhǔn)液，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2.4.3 其他溶液

抗體工作液 3mL，二抗工作液6mL，顯色液A 4mL，顯色液B 4mL，20X濃縮洗滌液 25mL，衍生化試劑10mL，樣本復(fù)溶工作液 50mL。

3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

3.1 蜂蜜樣品的前處理（稀釋倍數(shù)：1倍）

稱取1g蜂蜜樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，依次加入4mL去離子水，500 μL 1mol/L 鹽酸溶液，100 μL 衍生化試劑；用振蕩儀（2400r/m）振蕩30 s；在60℃水浴下，孵育2 h（注意：此衍生反應(yīng)步驟可用如下步驟代替：在37℃下，孵育14 h左右，效果相同。）

孵育完成后依次加入以下試劑：5mL磷酸鹽緩沖液，400 μL 1mol/L氫氧化鈉溶液，6mL乙酸乙酯；用振蕩儀（2400r/m）振蕩3min；在25℃4500rpm轉(zhuǎn)速下離心15min；移取3mL上層乙酸乙酯至10mL干凈干燥的玻璃試管中，于50℃下氮?dú)獯蹈?；加?mL正己烷，用振蕩儀（2000r/m） 振 蕩 3min， 再 加 入 500 μL 樣 本復(fù)溶工作液，用振蕩儀（2000r/m）振蕩3min；移入2mL聚苯乙烯離心管中，在12000r/m轉(zhuǎn)速條件下離心15min；去除上層有機(jī)相，取下層水相25μL用于分析（如果很難通過(guò)正己烷層移取較低水狀層，可以先取500 μL較低層后重復(fù)步驟7，然后再移取50 μL較低水狀層用于實(shí)驗(yàn)。）

表1 標(biāo)準(zhǔn)品種類及呋喃代謝物

表2 檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)靈敏度

表3 檢測(cè)項(xiàng)目及交叉反應(yīng)率

表4 呋喃它酮代謝物AMOZ實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 檢測(cè)步驟

（1）使用30min以上（注意：每種液體試劑使用前均須搖勻，所有試劑需避光保存）前將芯片置于室溫（20～25℃）平衡。

（2）取出需要數(shù)量的芯片微孔條插入框架中，確保其水平穩(wěn)固。將不用的微孔條放入自封袋密封，保存于2～8℃，不要冷凍。

（3）編號(hào)：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均做雙孔平行。

（4）加樣：依次加入25 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和25 μL抗體工作液到各自的微孔中，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃ 600r/m振蕩速度下反應(yīng)45min。

（5）洗板：小心揭開(kāi)蓋膜板，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μL/孔 洗滌反應(yīng)孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清楚的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破）。

（6）在每孔中加入二抗工作液50μL/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，37℃ 600r/m振蕩速度下反應(yīng)30min，取出重復(fù)步驟5。

（7）顯色：顯色液A和顯色液B臨用過(guò)時(shí)1∶1混合均勻（注意：過(guò)早混勻?qū)⒂绊懡Y(jié)果的檢測(cè)）。每孔加入混合液50 μL，37℃ 600r/m 避光顯色約12min。（如若微孔內(nèi)黑色沉淀較深或較淺，可適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，但顯色時(shí)間應(yīng)控制在11～13min內(nèi)。）

取出重復(fù)步驟5。

表5 呋喃唑酮代謝物AOZ實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 呋喃西林代謝物SEM實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（8）測(cè)定：將顯色后的芯片放入芯片分析儀中獲取圖像，啟用默認(rèn)的芯片專用軟件進(jìn)行自動(dòng)化分析，結(jié)果報(bào)告將自動(dòng)生成。

3.3 ELISA可視化微陣列芯片技術(shù)指標(biāo)

3.3.1 檢測(cè)項(xiàng)目及靈敏度（見(jiàn)表2）

3.3.2 交叉反應(yīng)率（見(jiàn)表3）

表7 呋喃妥因代謝物AHD實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 呋喃它酮代謝物AMOZ實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4）

4.2 呋喃唑酮代謝物AOZ實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表5）

4.3 呋喃西林代謝物SEM實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表6）

4.4 呋喃妥因代謝物AHD實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（見(jiàn)表7）

4.5 結(jié)論

蜂蜜中要求硝基呋喃類四類代謝物濃度要≤0.2μg/L，且四類代謝物濃度的和要＜0.5μg/L，所以試驗(yàn)所得編號(hào)為19和24不合格，其他均合格。

5 檢測(cè)注意事項(xiàng)

向孔內(nèi)移液時(shí)，移液嘴朝向芯片的前邊緣，不要接觸到芯片表面；所有樣品和試劑的添加，洗滌和孵育都要在芯片架上完成；在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔內(nèi)干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的線性；應(yīng)注意洗板拍干后立即進(jìn)行下一步操作；不要使用超過(guò)有效日期的芯片；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑；稀釋試劑或摻雜使用芯片板條會(huì)引起靈敏度、信號(hào)值的變化。