□ 李建平 邵淑娟 賈南南 曾慶真 武 玲 山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院

肉及其制品是人體蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的提升，肉及肉制品已經(jīng)成為人們餐桌的主角。因豬肉與牛肉的價(jià)格差距較大，在利益的驅(qū)使下，各種以假亂真，以次充好的事件頻頻發(fā)生。目前檢測(cè)肉類摻偽的方法有物理方法、化學(xué)方法、ELISA方法、色譜法、PCR方法等[1-3]。隨著分子生物技術(shù)研究的深入，PCR及熒光定量PCR越來(lái)越多地應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域[4-5]。本文旨在研究牛肉及其制品中DNA的提取純化方法及采用熒光定量PCR方法中的靈敏度較高的Taqman探針?lè)z測(cè)牛肉及其制品中的豬源性成分。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

生牛肉2份（超市）、熟牛肉2份（熟食店）、牛肉卷10份（火鍋店、自助餐廳）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

高速離心機(jī)、核酸蛋白分析儀、熒光定量PCR儀；CTAB（生工）、EDTA（碧云天）、SDS（生工）、DNA提取試劑盒（天根）、2×TaqMan Fast qPCR Master Mix（ 生工）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 火鍋底料中DNA的提取方法研究

2.1.1 改良 CTAB法[6]

稱取100 mg粉碎均勻的樣品置于2 mL離心管中，加入1 000 μL 2%的CTAB裂解液，4 μL的RNaseA酶（僅新鮮組織樣品加入），輕柔振蕩15 s，靜置5 min。然后再加入10μL的蛋白酶K，輕柔振蕩15 s，置于60 ℃水浴30 min，期間顛倒混勻2-3次；12 000 r/min離心5 min，取上清液700μL，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），輕緩顛倒15 s后室溫靜置1 min；12 000 r/min室溫下離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液于一新的1.5 mL離心管中，加入0.8倍體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后于-20 ℃靜置1～2 h沉淀DNA；12 000 r/min室溫離心10 min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀兩次。晾干，使用50 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，待測(cè)或于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 改良SDS法[7-8]

在2 mL離心管中加入100 mg樣品，加入1 mL 20% SDS混勻，65 ℃水浴30 min，期間顛倒數(shù)次；加入200 μL 3 mol/L NaAC溶液混勻，4 ℃ 15 000 r/min離心10 min；取上清液加等體積氯仿-異戊醇（24∶1）混勻，12 000 r/min室溫離心2 min，加入0.8體積預(yù)冷的異丙醇，沉淀DNA；12 000r/min室溫離心5 min，棄上清液；用70%乙醇洗沉淀兩次，晾干，使用50μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，待測(cè)或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 試劑盒法參照說(shuō)明書。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)

2.2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR方法[9-10]

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T3730.8-2013中設(shè)計(jì)以豬線粒體atp8基因組系列設(shè)計(jì)的引物與探針，分別提取不同來(lái)源的牛肉及其制品中的總DNA作為模板，在熒光定量PCR儀上對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 μL，DNF Buffer 2μL，10 μM Forward Primer 0.4 μL， 10 μM Reverse Primer 0.4 μL， 10 μM probe 0.4 μL，Template DNA 1μL (10-250 ng/μL)。反應(yīng)條件為：94 ℃，3 min，（94 ℃，5 s；60 ℃，30 s）40 cycles。內(nèi)參采集信號(hào)為YELLOW，目標(biāo)模板采集信號(hào)為GREEN。

2.2.2 檢測(cè)方法靈敏度與熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

將提取自豬肉組織的DNA分別進(jìn)行10倍等梯度稀釋，采用熒光定量PCR方法中的靈敏度較高的Taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)，以Ct值為35時(shí)對(duì)應(yīng)的模板DNA的濃度作為該方法的檢出限。同時(shí)根據(jù)各濃度梯度的擴(kuò)增曲線，建立Ct值-模板DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可應(yīng)用于牛肉及其制品中豬源性成分的定量檢測(cè)。

2.2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

分別用牛肉、羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉、馬肉等動(dòng)物樣品的DNA進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品DNA 提取及純化方法比較[11]

在DNA提取純化過(guò)程中，一般遵循兩個(gè)原則：一是防止和抑制DNA酶對(duì)DNA的降解；二是盡量減少對(duì)溶液中的DNA的機(jī)械剪切破壞。本研究設(shè)計(jì)的改良SDS法和改良CTAB法也是基于這兩個(gè)原則。CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。十二烷基磺酸鈉（SDS）是強(qiáng)效表面活性劑，可以將細(xì)胞膜裂解。DNA處理結(jié)果見(jiàn)表1。試劑盒法對(duì)生鮮組織及加工食品的提取的DNA的純度最好，就提取DNA的濃度來(lái)說(shuō)，SDS法及CTAB法提取的DNA的濃度均較高，在300-1000 ng/μL，試劑盒法提取的DNA的濃度在70-110 ng/μL?？偟膩?lái)說(shuō)，SDS法所用試劑價(jià)格便宜，花費(fèi)較小，且提取的DNA濃度較高，適合實(shí)驗(yàn)室使用；而試劑盒法操作簡(jiǎn)單迅速，提取DNA的純度較高，濃度對(duì)下一步進(jìn)行檢測(cè)適用，不用經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的稀釋。

表1 不同方法提取DNA結(jié)果比較

圖1 引物探針特異性分析圖

圖2a 熒光定量PCR對(duì)數(shù)曲線圖

圖2 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計(jì)圖

3.2 引物與探針特異性

用本實(shí)驗(yàn)的引物與探針在相同的熒光反應(yīng)條件下對(duì)豬肉、牛肉、羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉、馬肉等動(dòng)物樣品的DNA進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，除豬肉出現(xiàn)典型的對(duì)數(shù)曲線外，其他肉均未出現(xiàn)典型的對(duì)數(shù)曲線（如圖1所示）。

3.3 檢測(cè)方法靈敏度與熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖2中可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 為 Ct= -3.617×log(conc) + 24.860，r2=0.989 82，表明該方法在DNA模板稀釋濃度范圍內(nèi)線性良好。鑒于國(guó)內(nèi)外熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)均將Ct值為35時(shí)的DNA的質(zhì)量濃度作為方法的檢測(cè)限，根據(jù)本研究的標(biāo)準(zhǔn)曲線，Ct值為35時(shí)的熒光體系中DNA的質(zhì)量濃度為 8.165×10-5ng/μL。

4 討論

自國(guó)外假牛肉事件曝光以來(lái)，我國(guó)也加強(qiáng)了對(duì)牛肉及其制品的監(jiān)管，并且每年均針對(duì)市場(chǎng)需求對(duì)牛肉及其制品進(jìn)行抽檢，監(jiān)測(cè)牛肉的摻偽現(xiàn)象。本研究建立了牛肉及其制品中DNA的提取純化方法及采用熒光定量PCR方法中的靈敏度較高的Taqman探針?lè)z測(cè)牛肉及其制品中的豬源性成分，該方法特異性較好，檢測(cè)靈敏度高，并且通過(guò)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以有效地判定樣品是摻偽還是污染。運(yùn)用本方法對(duì)市售的牛肉及其制品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出部分樣品存在摻偽現(xiàn)象，少量樣品存在污染情況。所以本方法可以為監(jiān)管機(jī)關(guān)在牛肉及其制品的質(zhì)量控制提供有力的技術(shù)手段。