蔣 奕，俞龍浩*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

鯉魚是最重要的商業(yè)淡水魚類之一[1]，其因富含蛋白質(zhì)及不飽和脂肪酸而頗受消費者喜愛，但內(nèi)源性酶及微生物作用引起的脂質(zhì)氧化[2]使魚制品在貯藏過程中極易氧化變質(zhì)?；谀壳皞鹘y(tǒng)殺菌技術(shù)存在的種種不足，為了更好地延緩鯉魚制品的質(zhì)量惡化，冷殺菌技術(shù)逐漸成為研究熱點。

脈沖強光殺菌技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種非熱殺菌技術(shù)[3]，其利用瞬時、高強度的脈沖光能量對食品中各類微生物進(jìn)行快速滅菌[4-6]。因操作安全、殺菌均勻[7]等優(yōu)點，脈沖強光殺菌技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品、果蔬制品及糧油制品中[8]。何余堂等[9]研究脈沖強光技術(shù)對鮮食玉米的保鮮效果，結(jié)果表明，當(dāng)脈沖能量300 J、脈沖距離10 cm、閃照次數(shù)32 次時，玉米的保鮮效果最好。王勃等[10]的研究表明，當(dāng)閃照距離10 cm、脈沖能量400 J時，脈沖強光對月餅表面霉菌的殺菌率可達(dá)99.85%。

隨著人們健康安全意識的不斷提升，雙乙酸鈉作為高效、無毒的殺菌防腐劑越來越受到消費者的好評。1987年，世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織批準(zhǔn)雙乙酸鈉作為防腐劑添加到食品中[11]。雙乙酸鈉具有性能好[12]、應(yīng)用范圍廣、使用方便靈活（可直接加入到食品中或浸漬、噴灑）[13]及營養(yǎng)特殊等優(yōu)點[14]，被廣泛用于烘烤食品、肉制品、果蔬制品及飲料制品等加工食品中[15]。雙乙酸鈉對魚類有特殊的保鮮效果，將用10%雙乙酸鈉水溶液浸泡過的魚放入塑料袋內(nèi)，室溫（25 ℃）放置15 d仍然能夠保持新鮮[16]。

乳酸雙芽菌是一種新型的液態(tài)生物食品防腐劑[17]，由于其抑菌效果好、安全無副作用（在消化道內(nèi)降解為食品中所含的正常成分）、使用方便（可直接加入到食品中，也可經(jīng)噴霧干燥成粉后加入到食品中），目前已廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、飲料制品、烘焙食品及發(fā)酵食品等領(lǐng)域[18]。王心禮[19]的研究表明，乳酸雙芽菌對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果普遍優(yōu)于山梨酸鉀。侯靖等[20]發(fā)明的腐竹花生黃豆的專用防腐工藝專利表明，乳酸雙芽菌對其熟化的腐竹、花生、黃豆中的絕大多數(shù)菌有殺滅作用，5 d后霉菌發(fā)生概率在5%以下，且保質(zhì)期可達(dá)18 個月。

關(guān)于脈沖強光對食品殺菌的研究，國內(nèi)外從20世紀(jì)90年代初開始就有相關(guān)報道[21]。而關(guān)于脈沖強光殺菌結(jié)合保鮮劑在清蒸鯉魚中的應(yīng)用，國內(nèi)外還尚未報道。本研究的目的為優(yōu)化脈沖強光殺菌結(jié)合雙乙酸鈉和乳酸雙芽菌2 種保鮮劑應(yīng)用于清蒸鯉魚保鮮時的最佳殺菌條件，旨在為后續(xù)的魚制品加工保鮮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鯉魚購自黑龍江省大慶市北京華聯(lián)超市，所有鯉魚均在同一水產(chǎn)養(yǎng)殖場養(yǎng)殖，質(zhì)量（1 138.5±71.0） g，長度（39.8±1.0） cm。

雙乙酸鈉 南通奧凱生物科技開發(fā)有限公司；乳酸雙芽菌 綏化市藍(lán)源生物工程有限公司；平板計數(shù)瓊脂青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司；氯化鈉 遼寧泉瑞試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24電熱恒溫水浴鍋、DGG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DRP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；DL-CJ-2NDI潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；MXA3*18EA1脈沖強光消毒柜 常州市蘭諾光電科技有限公司；AR223CN電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；ScienTZ-04無菌均質(zhì)機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將鯉魚進(jìn)行敲擊式擊暈，隨后宰殺并去腮、去鱗、去內(nèi)臟，20 min內(nèi)運送到實驗室，用流動的自來水沖洗鯉魚體表和體內(nèi)的血液，并將魚腹腔內(nèi)的所有黑膜去除。清洗后的鯉魚進(jìn)行均勻分塊，備用。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

將魚肉塊分別浸入不同質(zhì)量濃度的雙乙酸鈉和乳酸雙芽菌中，浸泡0.5 h取出后清蒸（放入蔥、姜、鹽調(diào)味）；清蒸后冷卻至室溫，將肉塊裝入透明的聚乙烯包裝袋中熱封，隨即進(jìn)行脈沖強光殺菌處理。

按照不同條件對魚肉塊進(jìn)行處理，放置1 d后，測定其菌落總數(shù)，分別進(jìn)行單因素試驗：1）不同雙乙酸鈉質(zhì)量濃度（0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 g/100 mL）、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.13 g/100 mL、脈沖能量400 J、脈沖距離10 cm；2）不同乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度（0.05、0.09、0.13、0.17、0.21 g/100 mL）、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度0.9 g/100 mL、脈沖能量400 J、脈沖距離10 cm；3）不同脈沖能量（200、300、400、500、600 J）、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度0.9 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.13 g/100 mL、脈沖距離10 cm；4）不同脈沖距離（6、8、10、12、14 cm）、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度0.9 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.13 g/100 mL、脈沖能量400 J。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以脈沖能量、脈沖距離、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度4 個因素為自變量，以魚肉的菌落總數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

1.3.4 菌落總數(shù)測定

參考GB/T 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[22]。稱取25 g魚肉糜，置于225 mL無菌生理鹽水中，在振蕩器上充分振蕩混勻，制成魚肉糜和魚漿液比例為1∶10（m/V）的樣品勻液；用1 mL無菌吸管吸取1 mL樣品勻液，沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，制成1∶100（m/V）的樣品勻液；依此類推，選取3 個適宜稀釋度的樣品勻液（包括原液），各取1 mL稀釋液，于平板計數(shù)瓊脂平板上進(jìn)行涂布，（30±1） ℃培養(yǎng)（72±3） h，用平板計數(shù)法測定菌落總數(shù)。菌落總數(shù)按照下式計算。

式中：ΣC為平板菌落數(shù)之和；n1為第1稀釋度（稀釋100 倍）平板個數(shù)；n2為第2稀釋度（稀釋1 000 倍）平板個數(shù)；d為稀釋因子（第1稀釋度）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，采用Origin 2017軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 雙乙酸鈉質(zhì)量濃度對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響

圖1 雙乙酸鈉質(zhì)量濃度對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響Fig. 1 Effect of sodium diacetate concentration on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖1可知，隨著雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的增大，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢。當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度分別為0.5、0.7、0.9 g/100 mL時，其對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響顯著（P＜0.05）；雙乙酸鈉的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大為1.1、1.3 g/100 mL時，其對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響無顯著差異（P＞0.05）。與未用雙乙酸鈉處理的清蒸鯉魚相比，用雙乙酸鈉處理過的鯉魚菌落總數(shù)降低，其抗菌作用是由于其分子內(nèi)的單分子乙酸與類脂化合物能較好地相溶，因而能夠較有效地透過細(xì)胞壁，滲透進(jìn)入霉菌或細(xì)菌的細(xì)胞體中，干擾細(xì)胞間酶的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，使菌體細(xì)胞脫水死亡，從而起到抑菌作用[23]。殷銘等[24]的研究表明，用20%雙乙酸鈉水溶液對萵苣、草莓等果蔬進(jìn)行噴灑處理，果蔬表面的細(xì)菌總數(shù)取得了預(yù)期效果，與本研究的結(jié)果一致。當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.1 g/100 mL時，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)最小，故選取雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為0.9、1.1、1.3 g/100 mL進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

2.1.2 乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響

圖2 乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響Fig. 2 Effect of double buds Lactobacillus concentration on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖2可知，隨著乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的增大，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢。當(dāng)乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.21 g/100 mL時，與0.17 g/100 mL時相比，其對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。與未用乳酸雙芽菌處理的清蒸鯉魚相比，用乳酸雙芽菌處理過的鯉魚菌落總數(shù)降低，這可能是由于乳酸雙芽菌建立了酶生物合成和活性調(diào)節(jié)模式，使微生物的膜通透性增加，能量系統(tǒng)被破壞，從而抑制微生物的生長。當(dāng)乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.17 g/100 mL時，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)最小，故選取乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.13、0.17、0.21 g/100 mL進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

2.1.3 脈沖能量對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響

圖3 脈沖能量對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響Fig. 3 Effect of pulsed light energy on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖3可知，隨著脈沖能量的增加，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)呈先下降后趨于平緩的趨勢。與400 J相比，當(dāng)脈沖能量增加到500 J時，其對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響顯著（P＜0.05）；與500 J相比，當(dāng)脈沖能量增加到600 J時，其對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。脈沖能量是影響脈沖強光殺菌效果的重要因素[25]。與對照組相比，脈沖強光處理過的清蒸鯉魚菌落總數(shù)降低，這可能是由于微生物細(xì)胞具有比周圍介質(zhì)更高的脈沖吸收光[26]，脈沖強光處理對細(xì)胞膜造成了極大損傷，并大幅度降低了胞內(nèi)酶的活性，導(dǎo)致微生物死亡[27]。在保證殺菌效果的前提下，應(yīng)盡可能地節(jié)約能源，當(dāng)脈沖能量為500 J時，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)最小，故選取脈沖能量為400、500、600 J進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

2.1.4 脈沖距離對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響

圖4 脈沖距離對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響Fig. 4 Effect of light source distance on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖4可知，隨著脈沖距離的增大，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢。在8～14 cm范圍內(nèi)，脈沖燈光與樣品距離越近，樣品的菌落總數(shù)越小，滅菌效果也越明顯[28]。Wuytack等[29]認(rèn)為，脈沖強光對微生物的滅活主要是由于DNA結(jié)構(gòu)的改變，適當(dāng)?shù)拿}沖距離會增強殺菌效果。王勃等[30]的研究表明，當(dāng)脈沖距離為12.8 cm時，可使巴氏乳的霉菌滅菌率達(dá)99.97%，這顯示出脈沖距離對殺菌效果的積極影響。在本研究中，當(dāng)脈沖距離為8 cm時，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)最小，故選取脈沖距離為6、8、10 cm進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗及結(jié)果

采用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，一共包括29 個試驗點，其中包括24 個析因點（1～24）以及5 個零點（25～29）。各因素水平及編碼如表1所示，Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示。

表 1 響應(yīng)面因素水平與編碼Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

表 2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with response variable

對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到脈沖能量、脈沖距離、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度與菌落總數(shù)的二次回歸方程模型：Y=2.54+0.14A－0.54B－0.48C－0.11D+0.15AB+0.05AC+0.02AD+0.18BC+0.17BD+0.01CD+0.78A2+0.53B2+0.65C2+0.50D2。

表 3 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Significance test of regression model

由表3可知，所設(shè)計的模型成立，因為模型極顯著（P＜0.01），失擬項P=0.386 6＞0.05，不顯著。所得到的回歸方程的R2=0.981 0，=0.962 0，說明該回歸方程對試驗結(jié)果的擬合效果很好，試驗誤差小。因此，可用此模型分析和預(yù)測經(jīng)雙乙酸鈉和乳酸雙芽菌及脈沖強光殺菌處理后清蒸鯉魚的菌落總數(shù)。

模型一次項A、B、C、D，交互項AB、BC、BD，二次項A2、B2、C2、D2對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響顯著（P＜0.05），交互項AC、AD、CD對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。4 個因素對清蒸鯉魚菌落總數(shù)的影響大小順序為B＞C＞A＞D，即脈沖距離＞雙乙酸鈉質(zhì)量濃度＞脈沖能量＞乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度。

2.2.2 兩因子間的交互作用分析

圖5為當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.1 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.17 g/100 mL時，脈沖能量和脈沖距離的交互作用響應(yīng)面分析圖。由等高線圖可以看出，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)隨著脈沖能量的增加先減小后增大，且清蒸鯉魚的菌落總數(shù)也隨脈沖距離的增大先減小后增大，并且等高線圖呈橢圓形，說明脈沖能量與脈沖距離的交互效果較好[31]。從3D響應(yīng)面圖也可以看出，響應(yīng)曲面的坡度較陡，也說明脈沖能量和脈沖距離的交互效果顯著。

圖5 脈沖能量和脈沖距離的交互作用響應(yīng)面分析圖Fig. 5 Response surface plot showing the interaction between pulse energy and pulse distance

圖6 脈沖距離和雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖Fig. 6 Response surface plot showing the interaction between pulse distance and sodium diacetate concentration

圖6為當(dāng)乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.17 g/100 mL、脈沖能量為500 J時，脈沖距離和雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖。從3D響應(yīng)面圖可以看出，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)隨著脈沖距離的增加先減小后增大，隨雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的增大先減小后增大，并且響應(yīng)曲面的坡度較陡，說明脈沖距離與雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互效果較好。等高線圖呈橢圓形且較密集，也說明脈沖距離和雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互效果顯著。

圖7 脈沖距離和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖Fig. 7 Response surface plot showing the interaction between pulse distance and double buds Lactobacillus concentration

圖7為當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.1 g/100 mL、脈沖能量500 J時，脈沖距離和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖。由等高線圖可以看出，清蒸鯉魚的菌落總數(shù)隨著脈沖距離的增加先減小后增大，也隨乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的增大先減小后增大，并且等高線圖呈橢圓形且密集，說明脈沖距離與乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互效果較好。響應(yīng)曲面的坡度較陡，也說明脈沖距離和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互效果顯著。

2.2.3 最優(yōu)組合的確定及驗證

Design Expert V8.0.6軟件預(yù)測出的最優(yōu)實驗條件為脈沖能量482.61 J、脈沖距離8.72 cm、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度1.15 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.17 g/100 mL，在此條件下預(yù)測清蒸鯉魚的菌落總數(shù)為2.34（lg（CFU/g））。結(jié)合實際操作的可行性，將最優(yōu)實驗條件更改為脈沖能量480 J、脈沖距離9 cm、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度1.1 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.17 g/100 mL，在此條件下進(jìn)行驗證實驗，得到清蒸鯉魚的菌落總數(shù)為2.36（lg（CFU/g）），證明了該模型的可行性和有效性。

3 結(jié) 論

本研究探究了雙乙酸鈉質(zhì)量濃度、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度、脈沖能量和脈沖距離4 個因素對清蒸鯉魚滅菌效果的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化，建立了回歸方程模型，得到最佳處理條件為脈沖能量480 J、脈沖距離9 cm、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度1.1 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.17 g/100 mL。結(jié)果表明，脈沖強光結(jié)合雙乙酸鈉及乳酸雙芽菌等保鮮劑處理可有效降低清蒸鯉魚的菌落總數(shù)，是一種有效的魚制品保鮮技術(shù)。