王齊暉，劉學佳，胡錦瑞，褚云卓

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，沈陽 110001）

由于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯類藥物耐藥的腸桿菌科細菌所占比例的攀升，多黏菌素被重新應(yīng)用于治療腸桿菌科細菌所致的感染，被稱為控制多重耐藥腸桿菌科細菌感染的最后一道防線。

目前，腸桿菌科細菌對多黏菌素的耐藥機制尚未完全了解，2015年我國學者［1］首次在動物家畜和生肉中發(fā)現(xiàn)了一種新型質(zhì)粒攜帶的多黏菌素耐藥基因mcr-1，隨著相關(guān)研究［2-4］的開展，在歐洲、美洲、非洲也相繼發(fā)現(xiàn)了該基因的存在。有研究［5］表明mcr-1基因可能為多黏菌素耐藥的主要原因。目前國內(nèi)關(guān)于腸桿菌科細菌的mcr-1基因攜帶情況及其與多黏菌素耐藥表型相關(guān)性的研究較少，沈陽地區(qū)mcr-1基因在腸桿菌科細菌中的攜帶率尚屬未知。另有報道［6］稱少數(shù)攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌會對多黏菌素敏感，但其發(fā)生概率和機制尚不明確。

本研究篩查了2013年至2015年間沈陽地區(qū)三甲醫(yī)院分離的腸桿菌科細菌mcr-1基因的攜帶情況，利用脈沖場凝膠電泳 （pulsed-field gel electrophoresis，PFGE） 檢測沈陽地區(qū)mcr-1基因在腸桿菌科細菌中的流行情況，并通過測定攜帶mcr-1基因的腸桿菌科細菌對多黏菌素的最小抑菌濃度 （minimum inhibitory concentration，MIC） ，了解和探討mcr-1基因陽性菌株與多黏菌素耐藥表型之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源：收集2013年至2015年期間沈陽地區(qū)5家三甲醫(yī)院臨床分離的2 680株腸桿菌科細菌（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2 210株，中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院100株，遼寧省中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院170株，遼寧省人民醫(yī)院150株，沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院50株） 。其中，大腸埃希菌1 421株，肺炎克雷伯菌734株，其他腸桿菌科細菌525株。

1.1.2 試劑與儀器：PCR相關(guān)試劑 （日本TaKaRa公司） ；PCR引物 （上海生工生物工程有限公司合成） ；微量肉湯稀釋藥敏板 （天津金章科技發(fā)展有限公司） ；Seakem Gold agarose （瑞士LONZA公司 ） ； PCR儀 （GeneAmp PCR System 9700，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司） ；電泳儀和PFGE儀 （美國BIO-RAD公司） 。

1.2 方法

利用生工公司合成的引物 （MCR-L-F：5’-GCTCG GTCAGTCCGTTTG-3’；MCR-L-R：5’-GAATGCGGTG CGGTCTTT-3’） 行PCR檢測mcr-1基因：預變性94 ℃5 min；；94℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳初步確定陽性標本后，產(chǎn)物測序再次確認。

依據(jù)2018年新版歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會 （EUCAST） 的要求，采用微量肉湯稀釋法檢測mcr-1攜帶組及mcr-1基因未攜帶組菌株的MIC值，采用EUCAST的腸桿菌科細菌對多黏菌素折點的判讀標準評價藥敏結(jié)果。

利用PFGE判斷攜帶mcr-1基因的菌株間有無同源性，PFGE圖像用Bio Numertics （Version 5.0） 根據(jù)條帶間的相似性Dice系數(shù)，用非加權(quán)配對算數(shù)平均法 （unweighted pair group method using arithmetic，UPGMA） 進行聚類分析，判斷其流行情況。

應(yīng)用whonet 5.6軟件統(tǒng)計分析細菌的比例，采集科室的分布、樣本類型的分布以及藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 mcr-1基因攜帶情況（表1）

2 680株菌株中共有26株攜帶mcr-1基因，其中22株來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，4株來自遼寧中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，其他3家醫(yī)院沒有篩查到攜帶mcr-1基因的菌株。26株中有20株為大腸埃希菌，6株為肺炎克雷伯菌，其他菌種中沒有發(fā)現(xiàn)攜帶mcr-1基因的菌株。

表1 各類細菌攜帶mcr-1基因的比例Tab.1 Rate of occurrence of mcr-1 gene in various species in Enterobacteriaceae

2.2 藥敏試驗結(jié)果

18株對多黏菌素耐藥 （MIC≥4 μg/mL） ，有7株對多黏菌素的MIC為中介 （MIC=2 μg/mL） ，1株對多黏菌素敏感 （MIC≤1 μg/mL） 。其中大腸埃希菌對多黏菌素的耐藥率為65% （13/20） ，不敏感率 （耐藥和中介） 為95% （19/20） ；肺炎克雷伯菌的耐藥率為83.3% （5/6） ，不敏感率為100% （6/6） 。隨機抽取的52株未攜帶mcr-1基因的腸桿菌科細菌均對多黏菌素敏感 （MIC≤1 μg/mL） 。攜帶mcr-1基因的腸桿菌科細菌對多黏菌素的MIC50、MIC90和MIC range見表2。

表2 攜帶mcr-1基因的腸桿菌科細菌對多黏菌素的MIC50、MIC90和MIC range （μg/mL）Tab.2 MIC50，MIC90，and MIC range of colistin in the mcr-1-positive species Enterobacteriaceae （μg/mL）

2.3 同源性分析結(jié)果

利用PFGE分析中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床分離的19株攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌，結(jié)果顯示條帶差異較大，僅有2株聚類相似度接近80%，但時間間隔＞6個月，其余菌株沒有超過66%的聚類，根據(jù)Tenover原則，這些菌株之間無同源性，為多克隆菌株 （圖1） 。

3 討論

mcr-1基因被認為與多黏菌素耐藥有直接關(guān)系［1］。mcr-1基因目前至少在5種細菌中被發(fā)現(xiàn)，包括大腸埃希菌、腸道沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌以及陰溝腸桿菌，均為腸桿菌科細菌。截止至2016年4月份，mcr-1基因已經(jīng)至少在18個國家被證實存在［7］。本研究應(yīng)用特異性引物PCR擴增法從2 680株腸桿菌科細菌中篩選出了26株攜帶mcr-1基因的菌株，總攜帶率約為0.97%，其中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌攜帶mcr-1的比例分別為1.4%和0.8%。這個結(jié)果與LIU等［1］對中國人群 （廣東和浙江）調(diào)查得出的mcr-1基因攜帶率 （大腸埃希菌1.4%，肺炎克雷伯菌0.7%） 高度一致，說明位于中國東北部的沈陽地區(qū)mcr-1基因在腸桿菌科細菌中的攜帶率與南部地區(qū)差異不大。歐洲1項對2014年至2015年間在人群中分離的腸桿菌科細菌mcr-1基因攜帶率的調(diào)查發(fā)現(xiàn)其攜帶率＜0.1%［8］，分析其原因可能是我國畜牧業(yè)中大量應(yīng)用多黏菌素作為獸藥，對攜帶mcr-1基因的腸桿菌科細菌起到了藥物篩選作用［7］，而根據(jù)目前對mcr-1基因的篩選工作來看，從家禽中分離出該基因的比率最高［9］，推測國人食用家禽及其內(nèi)臟比重較高可能是導致我國人群中分離的腸桿菌科細菌攜帶mcr-1基因的概率遠高于歐美國家的重要原因。但目前關(guān)于mcr-1基因攜帶率的研究尚十分有限，還需要日后更大范圍、更大樣本量的統(tǒng)計研究。

圖1 脈沖場凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Results of PFGE

總體來看，本研究結(jié)果顯示，攜帶mcr-1基因與多黏菌素耐藥是密切相關(guān)的，未攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對多黏菌素均敏感，而26株攜帶mcr-1基因的菌株中18株對多黏菌素耐藥 （MIC≥4） ，有7株對多黏菌素中介敏感 （MIC=2） 。攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌MIC50和MIC90分別可達到4 μg/mL、4 μg/mL及4 μg/mL、8 μg/mL；攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對多黏菌素的耐藥率分別為65% （13/20）和83.3% （5/6） ，不敏感率為95% （19/20） 和100%（20/20） 。理論上mcr-1基因攜帶株應(yīng)當都對多黏菌素耐藥，但本研究中卻發(fā)現(xiàn)1株mcr-1基因攜帶株（MIC≤1） 對多黏菌素敏感，這與LIASSINE等［6］2016年報道的攜帶mcr-1基因的腸桿菌科細菌并不都對多黏菌素耐藥的結(jié)論相符合。推測可能是該敏感株中存在某種抑制mcr-1基因表達或滅活mcr-1基因編碼的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的機制，具體機制有待于進一步研究。

本研究挑選了分離自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院的19株攜帶mcr-1基因的大腸埃希菌進行PFGE，未發(fā)現(xiàn)單克隆株，提示目前攜帶mcr-1的細菌感染是獨立、偶發(fā)事件，并沒有發(fā)生院內(nèi)傳播和爆發(fā)流行的情況。

盡管目前臨床上分離腸桿菌科細菌mcr-1基因攜帶率并不高，但其已經(jīng)存在于致病菌群中并在傳播中。隨著各種抗生素的使用，多重耐藥菌群非?？赡軙瑫r攜帶多黏菌素的耐藥基因，屆時患者將無藥可用。多黏菌素近年來已批準應(yīng)用于臨床中，應(yīng)注意合理用藥，避免耐藥基因攜帶菌株的增多甚至暴發(fā)流行。