秦麗梅，吳琳，吳鎮(zhèn)先

（中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院修復一科，遼寧省口腔醫(yī)學研究所，沈陽 110002）

低強度脈沖超聲 （low-intensity pulsed ultrasound stimulation，LIPUS） 是一種以超聲波為形式的機械波，其強度范圍通常在5～100 mW/cm2之間，主要通過機械作用調(diào)節(jié)人體局部微環(huán)境從而促進成骨［1-2］。美國食品和藥品管理部門于1994年和2000年相繼批準了在臨床上應(yīng)用LIPUS治療新鮮骨折和骨不連，2017年英國醫(yī)學期刊出版了LIPUS治療骨折愈合的最新臨床實用指南［3］。LIPUS與人工骨修復材料聯(lián)合應(yīng)用對骨缺損修復的作用近年來日益受到關(guān)注。醫(yī)用多孔鈦合金支架具有良好的生物相容性、骨傳導性和機械性能，已應(yīng)用于臨床多領(lǐng)域。微弧氧化（micro-arc oxidation，MAO） 技術(shù)能在金屬材料表面構(gòu)建具有多孔結(jié)構(gòu)的氧化膜層，該層富含鈣、磷等離子，可提高材料的抗腐蝕性和生物活性，有利于成骨，是鈦金屬表面處理的新技術(shù)［4-5］。因此，表面經(jīng)MAO處理的多孔鈦合金 （micro-arc oxidation treated titanium alloy，MT） 支架可能會是一種是非常適宜修復骨缺損的支架材料。LIPUS的生物學效應(yīng)與其作用的時間、強度、頻率等參數(shù)密切相關(guān)。因此，在研究LIPUS聯(lián)合多孔MT材料用于大面積骨缺損修復時明確最優(yōu)的超聲參數(shù)非常重要。本研究將多孔MT與MC3T3-E1成骨細胞復合培養(yǎng)，從細胞黏附、細胞增殖和細胞分化幾個方面評價不同強度LIPUS刺激對支架材料上成骨細胞的生物學行為的影響，篩選出最適宜的LIPUS強度參數(shù)，為進一步研究LIPUS作用下高強韌多孔鈦人工骨材料的生物學作用及機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 多孔MT：由中國科學院金屬研究所制作提供，樣品為直徑10 mm、高度2 mm的圓柱體，孔徑400～500 μm，孔隙率65%～70%。依次用丙酮、75%乙醇、去離子水清洗樣品，并高溫高壓滅菌后備用。細胞接種前4 h將多孔MT材料放入培養(yǎng)液中抽真空4 h，吸除材料內(nèi)氣體并使材料達到預濕潤狀態(tài)。

1.1.2 細胞：小鼠MC3T3-E1成骨細胞由中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院中心實驗室提供。

1.1.3 主要儀器與試劑：Sonicator 740型超聲波發(fā)生器 （美國Mettler Electronics公司），LSRFortessa 流式細胞儀 （美國BD公司） ，Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡 （scanning electron microscope，SEM） （日本HITACHI公司） ，超聲耦合劑 （美國Sonic Relief公司） ，ALP試劑盒 （南京建成有限公司） ，MTT和DMSO （美國Sigma公司） ，碘化丙啶染液和BCA總蛋白試劑盒（北京鼎國試劑公司） 。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：將多孔MT支架材料隨機分為5組（0 MT、10 MT、30 MT、60 MT、100 MT組） ，分別加載不同的超聲強度。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：當細胞達到80%融合時，用0.25%胰酶消化細胞，吹打細胞成單細胞懸液。調(diào)整細胞懸液密度［用于SEM、MTT、細胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）、堿性磷 酸 酶（alkaline phosphate，ALP）檢測的細胞懸液密度分別為8×105/mL、8×105/mL、2×106/mL、2×106/mL］，將50 μL細 胞 懸 液 緩 慢 均勻地接種到支架材料上，靜置孵育2 h后，每孔加入1 mL培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱中靜置24 h使細胞貼壁穩(wěn)定。將細胞脫落較多的樣本丟棄，其余樣本隨機分為實驗組和對照組，每2 d換液1次，每組保證3個樣本。

1.2.3 超聲加載：超聲加載參數(shù)為頻率1 MHz，脈沖寬度1 ms，脈沖重復頻率100 Hz，20 min/次，1次/d，5組材料加載強度分別為0、10、30、60、100 mW/cm2。其中，強度0 mW/cm2組為不開功率源的假輻照。超聲波輻照時，在超聲探頭和孔板間使用超聲耦合劑，避免二者間產(chǎn)生氣泡引起超聲波的反射和衰減。

1.2.4 細胞形態(tài)學觀察：各組細胞培養(yǎng)4 d后，清洗試件，2.5%戊二醛4 ℃固定 24 h，然后將各試件乙醇梯度逐級脫水，干燥，表面噴金后用SEM觀察材料表面細胞的附著情況。

1.2.5 MTT檢測：各組細胞培養(yǎng)1、4、7 d后，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每孔加入200 μL MTT液及800 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育4 h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入1 mL DMSO，于震蕩器上震蕩10 min后移入96孔板中，每孔200 μL，在490 nm波長下測其OD值。

1.2.6 流式細胞儀檢測：各組細胞培養(yǎng)5 d后取出，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，消化細胞并離心收集細胞沉淀，用預冷的PBS洗滌細胞沉淀2次，然后以預冷的70%乙醇溶液輕吹混勻沉淀細胞，4 ℃固定過夜。次日再次離心固定的細胞，預冷的PBS洗滌細胞1次，重懸細胞后再次離心，去除上清。每管細胞中加入400 μL碘化丙啶染液，于37 ℃下避光靜置染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期 （波長488 nm） ，計算細胞PI。

1.2.7 ALP檢測：各組細胞培養(yǎng)1、4、7 d后，棄除原培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，胰酶消化，離心，再次加入PBS吹打材料上剩余細胞，收集并離心，棄除上清液，采用化學、物理雙重裂解法裂解細胞，低溫高速離心5 min，取上清液備用，按照總蛋白試劑盒和ALP定量檢測試劑盒說明書分別對樣品進行檢測，按公式計算細胞內(nèi)ALP含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 SEM觀察結(jié)果

細胞接種4 d后，在各組多孔MT材料表面均伸展良好，細胞間靠偽足相互連接，并可見細胞長入材料孔徑內(nèi)部 （圖1） 。

2.2 MTT

各組細胞MTT值均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。在培養(yǎng)1、3、7 d時，100 MT組的MTT值低于其他4組，有統(tǒng)計學差異 （P ＜ 0.05） ，而其他4組間無統(tǒng)計學差異 （圖2） 。

2.3 PI值

圖1 SEM觀察培養(yǎng)4 d后材料表面成骨細胞的形態(tài)Fig.1 SEM images of osteoblasts at 4 days post seeding on scaffold materials

圖2 不同超聲強度刺激下各組MTT值Fig.2 The MTT content in each group with stimulation at different ultrasound intensities

在共培養(yǎng)、超聲加載5 d后，100 MT的PI值低于其他4組，有統(tǒng)計學差異 （P ＜ 0.05） ，而其他4組之間無統(tǒng)計學差異。進一步表明100 mW/cm2的LIPUS超聲強度更加不利于MC3T3成骨細胞的增殖，而不同的超聲強度參數(shù)并未對其他4組成骨細胞的增殖造成顯著的影響 （圖3） 。

2.3 ALP值

圖3 培養(yǎng)5 d時各組材料表面細胞的增殖指數(shù)Fig.3 The cell proliferation index in the different groups at 5 days post seeding on scaffold materials

各組細胞的ALP值隨著培養(yǎng)時間的延長都有一個先增高再降低的趨勢，在同一時間點上，30 MT組的ALP值高于其他4組，有統(tǒng)計學差異 （P ＜ 0.05） 。表明當LIPUS的超聲強度為30 mW/cm2時，更有利于促進MC3T3細胞的成骨向分化 （圖4） 。

3 討論

圖4 不同超聲強度刺激下每組ALP活性結(jié)果Fig.4 ALP content in each group with stimulation at different ultrasound intensities

LIPUS對骨折和骨不連愈合的促進作用已經(jīng)被逐漸認可，它能通過作用于不同的生物成分促進骨再生的整個過程，目前已被廣泛應(yīng)用于輔助促進大面積骨缺損愈合［6］。LIPUS發(fā)射的脈沖式超聲波能克服一般超聲波的致熱不良反應(yīng)，產(chǎn)生的直接和間接的機械作用力可通過聲流、聲波的輻射、液體流動等引起微循環(huán)改變，利于細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換，制造更有利于細胞生長的生物學微環(huán)境，從而引發(fā)細胞的一系列生物行為變化。近年來，將LIPUS與多孔三維支架材料聯(lián)合應(yīng)用于體外細胞培養(yǎng)的研究受到越來越多的關(guān)注。WU等［7］將碳化硅支架材料與成骨細胞復合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)LIPUS能夠增加細胞在支架材料內(nèi)部的長入深度，促進細胞增殖。

LIPUS作用的結(jié)果受到超聲波的強度、頻率、輻照時間等參數(shù)設(shè)置、加載裝置、細胞類型、組織類型等多重因素的影響［8-13］。ZHOU等［10］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)40 mW/cm2的超聲能明顯促進新骨形成，提高骨質(zhì)疏松小鼠的骨結(jié)合能力。XU等［11］研究發(fā)現(xiàn)，60 mW/cm2的超聲強度對造血干細胞增殖的作用最為顯著。安恒遠等［12］的研究表明不同強度的LIPUS均可促進兔軟骨細胞增殖，其中以40 mW/cm2的促進作用最顯著。而AKAGI等［13］的研究認為LIPUS對細胞的增殖無影響，但能促進分化，且輻照時間和頻率的差異會影響分化結(jié)果。在LIPUS對小鼠前成骨細胞生物行為影響的研究［14-15］中，常用的超聲參數(shù)為強度30 mW/cm2，時間20 min，頻率1～1.5 MHz，但這一參數(shù)也沒有受到國內(nèi)外學者的一致認可。KATIYAR等［16］通過體外研究得出結(jié)論，不同大小的超聲強度會不同程度地影響MC3T3-E1細胞的增殖，而不同頻率和輻照時間對細胞增殖的影響無統(tǒng)計學差異。ANGLE等［8］發(fā)現(xiàn)低于30 mW/cm2的強度對成骨細胞依然有效，并且在各個強度組中2 mW/cm2組的礦化效果最好。綜上所述，LIPUS的作用效果受到多種因素的影響，為了今后能更好地研究LIPUS聯(lián)合多孔鈦合金支架材料對修復大面積骨缺損中各種生物學行為的影響，明確最佳的超聲參數(shù)是非常必要的。

本研究通過SEM觀察各組材料表面成骨細胞的黏附狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)各組材料上細胞均伸展良好，并長入至材料孔徑內(nèi)部，表明LIPUS不會影響成骨細胞在多孔MT上的黏附。本研究中LIPUS強度為100 mW/cm2組的MTT值低于其他組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） ，而其他組之間無統(tǒng)計學差異，流式細胞儀檢測結(jié)果進一步驗證了MTT的檢測結(jié)果。提示當超聲強度達到100 mW/cm2時，會在一定程度上抑制MC3T3細胞的增殖。值得注意的是，與假輻照的0 MT組相比，10 MT、30 MT和60 MT這3個組的細胞在增殖方面的檢測結(jié)果均不具有統(tǒng)計學差異，表明在本實驗條件下，LIPUS對MC3T3細胞增殖沒有促進作用。關(guān)于LIPUS對細胞增殖的影響，目前國內(nèi)外研究尚無統(tǒng)一定論，大部分研究［9，15］認為它能促進細胞增殖，然而部分研究［17］認為它對細胞增殖無明顯影響，甚至還有研究［18］顯示LIPUS能夠抑制細胞的增殖。LIPUS對細胞增殖產(chǎn)生不同結(jié)果的具體機制尚不清楚，可能與細胞、材料或者超聲參數(shù)有關(guān)，還有待于進一步研究。

ALP是成骨細胞分泌的一種蛋白酶，是成骨細胞早期分化的特異性標志之一。本實驗對各組材料上細胞的ALP含量進行了定量檢測，結(jié)果顯示，在檢測的各個時間點上30 MT組的ALP值均高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） 。表明強度為30 mW/cm2的LIPUS能顯著促進MC3T3細胞的成骨向分化，與之前國內(nèi)外的大量研究［13-15］結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，30 mW/cm2的強度是促進MC3T3細胞成骨向分化的最優(yōu)超聲強度參數(shù)。本研究組將采用此超聲強度參數(shù)進行后續(xù)的深入研究。