李 工 薛曉光 鄭劍霄 邱圣紅

(廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院放療科，廣東 廣州 510006)

研究顯示，抗氧化劑有助于癌癥的預(yù)防〔1，2〕。生物通過有氧代謝而生存，有氧代謝產(chǎn)生活性氧(ROS)，正常情況下，人體內(nèi)的過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化劑會快速清除ROS，然而一旦生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)無法承載氧化應(yīng)激負(fù)荷時(shí)，ROS便會攻擊DNA，造成DNA斷裂、堿基錯配、DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)等多種DNA損傷〔3,4〕。受損的DNA在復(fù)制和分裂時(shí)可形成突變，進(jìn)而激活癌基因、抑癌基因失活，造成細(xì)胞生長周期紊亂。氧自由基對DNA造成的損傷與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔5〕。抗氧化劑能提供電子，從而中和ROS或者其他可以引起DNA損傷并促進(jìn)腫瘤發(fā)生的自由基。在肺癌細(xì)胞中基因突變可活化細(xì)胞內(nèi)源的抗氧化體系，使細(xì)胞ROS降低從而促進(jìn)細(xì)胞生長〔6〕。本研究旨在探討抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和維生素(Vitamin)E在人肺癌細(xì)胞生長中的作用。

1試劑與方法

1.1主要試劑 NAC，Vitamin E(Sigma，美國)，蛋白提取試劑盒(美國，Thermo Scientific)，RPMI1640培養(yǎng)液，血清(美國，gibco)p53抗體、p-p53抗體、γ-H2AM抗體和Actin抗體(Abcam，美國)，3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒，二氯熒光素雙酶酸鹽(DCFH-DA)探針(中國，碧云天)，5-溴脫氧尿苷嘧啶(BrdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒(艾美捷，美國)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395由本實(shí)驗(yàn)室凍存保存，培養(yǎng)于10%胎牛血清+1%抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在5% CO2，相對濕度95%，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1CCK-8檢測肺腺癌細(xì)胞增殖情況 人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395胰酶消化，制成細(xì)胞懸液后按103的細(xì)胞密度接種于96孔版中，待細(xì)胞長到60%左右開始換入無10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞饑餓24 h后，分別加入1 mmol/L NAC(NAC組)，0.1 g/L和0.5 g/L Vitamin E(Vitamin E低劑量組和Vitamin E高劑量組)，同時(shí)設(shè)空白對照組(對照組)；2 μl shSCR(hsSCR組),2 μl shTP53(shTP53組)，2 μl shSCR+1 mmol/L NAC(shSCR+NAC組),2 μl shTP53+1 mmol/L NAC(shTP53+NAC組)，每孔加完藥后放入無FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測。

1.3.2BrdU摻入檢測肺腺瘤細(xì)胞增殖情況 人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395饑餓24 h后，分別加入1 mmol/L NAC,0.5 g/L Vitamin E無FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，胰酶消化離心10 min，每管中加入500 μl洗滌液重懸細(xì)胞，10 min離心洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)在105/管。向1.5 EP管中加入500 μl固定液重懸細(xì)胞，4℃過夜，然后向1.5 EP管中加入500 μl洗滌液離心10 min洗滌2次。1.5 EP管中加入500 μl通透液重懸細(xì)胞，冰上孵育2 min，然后向1.5 EP管中加入500 μl洗滌液離心10 min洗滌2次。加入300 μl DNA變性工作液重懸細(xì)胞，37℃反應(yīng)30 min，然后再加入洗滌液離心10 min洗滌2次。以195 μl染色緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl(0.125 μg)FITC-BrdU抗體，4℃避光孵育30 min。熒光顯微鏡下(日本OLYMPUS公司)觀察。

1.3.3熒光顯微鏡檢測肺腺癌細(xì)胞ROS水平 人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395消化計(jì)數(shù)后在24孔板中接種5×104個細(xì)胞每孔，貼壁培養(yǎng)24 h。分別加入1 mmol/L NAC(NAC組)和0.5 g/L Vitamin E(Vitamin E組)培養(yǎng)12 h，同時(shí)設(shè)空白對照組。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次。用無血清RPMI1640培養(yǎng)液按照1∶1 000稀釋DCFH-DA探針，終濃度為10 μl/L，每孔加入500 μl稀釋后的探針，培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清RPMI1640洗滌細(xì)胞3次，充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA探針，熒光顯微鏡下定性檢測細(xì)胞ROS相對熒光強(qiáng)度。

1.3.4免疫組化檢測肺腺癌細(xì)胞DNA損傷 人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395，饑餓24 h后，分別加入終濃度1 mmol/L NAC，0.5 g/L Vitamin E無FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，制備肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395細(xì)胞切片，干燥處理后置于二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中進(jìn)行脫蠟處理，梯度酒精水化處理。置于3%的H2O2溶液中，在室溫下孵育10 min，PBS洗滌，重復(fù)3次。將片子放入檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)中，進(jìn)行抗原熱修復(fù)。滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min。加入稀釋好的8-羥基鳥嘌呤抗體(1∶1 000)，4℃過夜處理，置于烤箱中復(fù)溫30 min，溫度設(shè)為37℃，PBST沖洗，重復(fù)3次。滴加生物素抗兔二抗，在37℃的環(huán)境下孵育1 min，PBST洗滌，重復(fù)3次。DAB顯色，顯色終止后對切片進(jìn)行清洗。滴加蘇木素，在室溫下反應(yīng)3 min，清水沖洗，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍(lán)5 min。梯度酒精脫水處理，二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中透明，晾干，中性樹膠封片。以PBS液為陰性對照，在顯微鏡(CK30-F200，日本Olympus公司)下對各切片的著色情況進(jìn)行觀察計(jì)算8-羥基鳥嘌呤陽性表達(dá)率。

1.3.5Western印跡 人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395消化計(jì)數(shù)后在6孔板中接種5×105個細(xì)胞每孔，貼壁培養(yǎng)24 h。分別加入1 mmol/L NAC(NAC組)和0.5 g/L Vitamin E(Vitamin E組)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)空白對照組，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，用BCA法測定每組蛋白質(zhì)濃度，每孔總蛋白上樣量為50 μg，上樣后進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝脈電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)膜(80 V，90 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜5 min/3次。分別用如下一抗p53(1∶500)、p-p53(1∶500)、γ-H2AM(1∶5 000)和Actin(1∶1 000)4℃過夜，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用稀釋比例為1∶1 000的對應(yīng)二抗37℃搖床反應(yīng)1 h，TBST洗膜5 min/5次。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行顯色后凝膠成像分析系統(tǒng)拍照(中國，Tanon)，采用LabWorks4.6軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395增殖情況比較 NAC組〔(22.8±0.4)%〕細(xì)胞生長經(jīng)顯著高于對照組〔(8.7±0.2)%〕(P<0.05)。與對照組相比，Vitamin E低劑量組、高劑量組促進(jìn)細(xì)胞增殖，但Vitamin E低劑量組細(xì)胞生長率〔(13.1±0.3)%〕與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Vitamin E高劑量組〔(20.3±0.4)%〕與對照組比較增加了133.3%(P<0.05)。shSCR組、shTP53組、shSCR+NAC組、shTP53+NAC組細(xì)胞存活率分別為(7.27±0.08)%、(12.5±2.13)%、(13.62±2.41)%、(14.31±1.54)%。與shSCR組相比，shTP53組和shTP53+NAC組細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05)，而與shTP53組相比，shTP53+NAC組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，抑制p53后NAC并未促進(jìn)細(xì)胞增殖。

2.2各組肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395增殖情況比較 與對照組相比，NAC組和Vitamin E組肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395熒光強(qiáng)度增加，NAC組和Vitamin E組Brdu 陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比〔(2.6±0.2)%、(2.7±0.2)%〕顯著高于對照組〔(1.8±0.1)%〕，增加了44.5%、46.1%(均P<0.05)。

2.3各組肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395 ROS生成情況比較 與對照組(15.3±0.4)相比，NAC組(9.2±0.2)和Vitamin E組(9.6±0.2)ROS分別降低了40.1%和37.2%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4各組肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395 DNA損傷比較 與對照組〔(26.7±0.8)%〕相比，NAC組和Vitamin E組8-羥基鳥嘌呤陽性表達(dá)率〔(21.3±0.6)%、(20.6±0.5)%〕分別降低了20.4%和22.8%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。如圖1。

2.5各組p53、p-p53和γ-H2AM蛋白水平比較 與對照組相比，NAC組和Vitamin E組p53、p-p53和γ-H2AM蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，基本降低到零表達(dá)。如圖2、表1。

圖1 免疫組化檢測肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395 DNA損傷(×400)

圖2 Western印跡檢測肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395中p53和γ-H2AM蛋白磷酸化水平

組別p53p-p53γ-H2AM對照組0.82±0.050.89±0.060.40±0.03NAC組0.00±0.001)0.00±0.001)0.00±0.001)Vitamin E組0.12±0.021)0.00±0.001)0.00±0.001)

與對照組相比:1)P<0.05

3 討 論

NAC可促進(jìn)谷胱甘肽(GSH)合成，同時(shí)還可以通過其還原性硫基捕獲未成對的電子起到抗氧化作用〔7,8〕。Vitamin E可清除體內(nèi)自由基，防止不飽和脂肪酸過度氧化，減少脂質(zhì)過氧化物水平〔9,10〕。有研究指出〔11〕，抗氧化劑可在某些特定的情況下促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。Xu等〔12〕研究表明原癌基因刺激轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2所介導(dǎo)的內(nèi)源抗氧化劑的表達(dá)，從而減少ROS，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，與本研究結(jié)果一致?？寡趸瘎┛梢詼p少內(nèi)源性ROS防御體系中的基因表達(dá)，這與ROS數(shù)量降低，DNA損傷程度下降，并且GSH/氧化型(GSSG)的值增加相關(guān)〔13〕。說明加入NAC或Vitamin E后，能降低肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395中的ROS水平，肺腺癌細(xì)胞中內(nèi)源性的ROS防御體系被下調(diào)。

本研究結(jié)果提示p-53磷酸化水平的下降可能是抗氧化劑所誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395增殖的作用機(jī)制之一。同時(shí)筆者推測抗氧化劑NAC引起p53表達(dá)下降的一個可能原因是抗氧化劑可以降低DNA氧化損傷，γ-H2AM的磷酸化，從而抑制p53的活化。但這種解釋還需要進(jìn)一步明確。由于腫瘤細(xì)胞模型的限制，只能研究抗氧化劑對于腫瘤細(xì)胞發(fā)展的影響，而不能進(jìn)行抗氧化劑對于腫瘤細(xì)胞發(fā)生過程影響的研究。在之前的研究中，抗氧化劑對于化學(xué)方法引起的肺癌具有保護(hù)作用，同時(shí)，高劑量的ROS也可能與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)〔14〕。然而大量實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)表明，大豆異黃酮、胡蘿卜素、Vitamin和NAC等抗氧化劑并不適合作為預(yù)防肺癌的藥物，并且大量的使用這些抗氧化劑可能會增加機(jī)體患癌概率〔15,16〕。由于抗氧化劑的作用依賴于p53，所以在人體中TP53的突變發(fā)生在腫瘤發(fā)展的晚期過程，而抗氧化劑主要加快了癌癥發(fā)展的早期過程。這表明，處于肺癌早期的患者服用抗氧化劑是非常危險(xiǎn)的，這也許也是經(jīng)常吸煙的人更容易患有慢性阻塞性肺疾病的原因之一，因?yàn)槿嗽谖鼰煹倪^程中會攝入大量的NAC。

本研究表明抗氧化劑NAC和Vitamin E可通過降低肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395中ROS引起的DNA損傷，從而降低p53的磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395的增殖，為肺癌患者服用抗氧化劑的危害提供了理論支持，但此次研究僅在細(xì)胞層次上進(jìn)行了討論，此后還需更多的臨床數(shù)據(jù)予以確認(rèn)。