任德啟 孟 毅 鄭偉峰 關(guān)東升 崔應(yīng)麟

(河南省中醫(yī)院腦二病區(qū)，河南 鄭州 450000)

腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，其中最為常見的是缺血性腦血管疾病〔1〕。腦缺血發(fā)生后，可引起機(jī)體發(fā)生一系列的變化，包括葡萄糖和氧氣供應(yīng)中斷、線粒體功能障礙、酸中毒、氧化應(yīng)激、炎癥等，最終使神經(jīng)元死亡〔2〕。在治療缺血性腦血管疾病時(shí)經(jīng)常采用再灌注的方法，但會(huì)引起腦缺血再灌注損傷〔3〕。研究顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞在保護(hù)神經(jīng)元和腦損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽、分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素等〔4〕。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人參皂苷對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈缺血引起神經(jīng)元死亡具有阻止作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究人參皂苷對(duì)體外培養(yǎng)的腦缺血再灌注損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧(ROS)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 出生1～3 d的SD大鼠購(gòu)自上海凱學(xué)生物科技有限公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；人參皂苷購(gòu)自浙江亞克藥業(yè)有限公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2一抗、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1一抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH )一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下分離出SD大鼠腦組織，立即用冰冷的解剖液清洗去除殘留血液，顯微鏡下分離出大腦皮質(zhì)，眼科剪剪成1 mm3左右的碎塊，玻璃吸管反復(fù)吹打，加入0.25%的胰酶常溫下消化20 min，反復(fù)4次，離心，棄上清，將洗滌后的星形膠質(zhì)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于含10%胎牛血清(FBS)和雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，胰酶消化傳代。待對(duì)數(shù)期細(xì)胞的純度達(dá)到90%可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷模型的建立 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml接種于96孔板中，采用無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將其放入恒溫培養(yǎng)箱中，充入5%CO2、1%O2、94%N2培養(yǎng)2 h，然后將培養(yǎng)基更換為含有10% FBS的高糖培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，即為缺血再灌注模型。

1.4實(shí)驗(yàn)分組和藥物干預(yù) 取100 μl 1×105/ml的細(xì)胞接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入5、10、20、40、80 μg/ml的人參皂苷，每孔5個(gè)復(fù)孔，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組為未經(jīng)處理的細(xì)胞；模型組為缺血再灌注細(xì)胞，不加藥物處理；給藥組為缺血再灌注細(xì)胞，分別加入人參皂苷。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取1×105個(gè)各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h，每孔5個(gè)復(fù)孔，根據(jù)試劑說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入500 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，直至出現(xiàn)結(jié)晶紫后終止實(shí)驗(yàn)，在570 nm波長(zhǎng)下記錄各孔的吸光值(OD值)。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)照組、模型組、給藥組(20 μg/ml)細(xì)胞培養(yǎng)48 h，0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/ml，加入5 μl Annexin V-FITC，避光條件下置于37℃下孵育30 min，加入5 μl碘化丙啶(PI)，避光反應(yīng)5 min。置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7ROS檢測(cè) 對(duì)照組、模型組、給藥組(20 μg/ml)對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/ml接種于6孔培養(yǎng)板，分組處理后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，離心，棄上清，加入10 μmol/L DCFH-DA懸浮細(xì)胞，常溫下避光反應(yīng)30 min，PBS清洗2次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

1.8Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1蛋白表達(dá) 收集對(duì)照組、模型組、給藥組(20 μg/ml)細(xì)胞，加入0.5 μmol蛋白酶抑制劑，振蕩混合均勻，置于冰上反應(yīng)10 min，16 000 r/min離心10 min，所得上清即為所需蛋白，根據(jù)聚氰丙烯酸正丁酯(BCA)試劑說(shuō)明書檢測(cè)蛋白濃度。在蛋白樣品中加入4倍體積的5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白緩沖液，100℃煮沸10 min。配制10%分離膠和5%濃縮膠加入玻璃板中，置于電泳池中，80 V電泳20 min，然后120 V電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部，停止電泳。將SDS-PAGE 120 V電壓轉(zhuǎn)膜150 min，取出轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜，使用5%脫脂奶粉置于搖床上封閉60 min，PBST清洗3次×5 min，加入提前稀釋的一抗，4℃冰箱中孵育過(guò)夜，然后37℃恒溫箱中復(fù)溫，PBST清洗3次×5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃下孵育60 min，PBST清洗3次×5 min，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液，暗室中曝光，加入顯影液和定影液，晾干膠片，Image J軟件分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度人參皂苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組(0.684±0.076)相比，模型組細(xì)胞OD值(0.340±0.021)顯著降低(t=7.557，P=0.002)，人參皂苷只有20 μg/ml時(shí)OD值(0.882±0.083)顯著高于對(duì)照組(t=3.047，P=0.038)，與模型組相比，給藥組細(xì)胞OD值顯著增高(F=20.384，P=0.000)，其中5 μg/ml時(shí)0.709±0.075，10 μg/ml時(shí)0.747±0.068,40 μg/ml時(shí)0.721±0.090，80 μg/ml時(shí)0.715±0.058，20 μg/ml為人參皂苷的最佳給藥量，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以20 μg/ml人參皂苷為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.2人參皂苷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組(10.356%±1.428%)相比，模型組和給藥組細(xì)胞凋亡率(42.486%±6.753%，20.145%±4.657%)顯著增高(t=8.063，3.481；P=0.001，0.025)；與模型組相比，給藥組顯著降低(t=4.717，P=0.009)。

2.3人參皂苷對(duì)ROS水平的影響 與對(duì)照組(100.036%±0.012%)相比，模型組和給藥組ROS的表達(dá)量(254.353%±6.879%，150.521%±10.639%)顯著增加(t=15.835，8.219，P=0.000，0.001)，與模型組相比，給藥組顯著降低(t=9.014，P=0.001)。

2.4人參皂苷對(duì)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1蛋白水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組和給藥組Bcl-2(t=11.357，3.130；P=0.000，0.035)、CyclinD1(t=10.880，6.574；P=0.000，0.003)蛋白表達(dá)量顯著降低，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(t=7.715，5.626；P=0.002，0.005)；與模型組相比，給藥組Bcl-2、CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著升高(t=10.212，4.545；P=0.001，0.011)，Bax蛋白表達(dá)量顯著降低(t=3.656，P=0.022)。見圖1，表1。

圖1 人參皂苷對(duì)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1蛋白水平的影響

組別Bcl-2BaxCyclinD1對(duì)照組0.765±0.0730.285±0.0160.822±0.069模型組0.272±0.0181)0.553±0.0581)0.361±0.0251)給藥組0.602±0.0531)2)0.410±0.0351)2)0.503±0.0481)2)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

3 討 論

臨床上最常見的腦血管疾病是缺血性腦血管病變〔6〕。腦缺血再灌注能夠引起神經(jīng)中毒、組織出血、氧化損傷、炎癥反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞壞死等，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后〔7〕。研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的神經(jīng)功能恢復(fù)具有積極或消極的作用〔8〕。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞中數(shù)量較多的一類細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元功能的維持、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)pH值和體液平衡、離子濃度、血流量具有重要作用，參與新陳代謝、形成血腦屏障等生物學(xué)作用〔9〕。大量研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血再灌注損傷中的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一定量的功能因子，如多種功能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子，當(dāng)細(xì)胞的通透性增強(qiáng)時(shí)，這些因子以胞吐等形式進(jìn)入細(xì)胞液中，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用〔10,11〕。研究表明以天麻和鉤藤(主要成分為天麻素和鉤藤堿)為主的中藥制劑對(duì)腦缺血再灌注4 h的星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率具有一定保護(hù)作用，說(shuō)明某些中藥可緩解腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡作用〔12〕。擬人參皂苷在大鼠腦缺血組織損傷的病理過(guò)程中，可減小腦梗死的面積，增強(qiáng)抗氧化能力〔13〕，但其具體的作用機(jī)制不太清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，人參皂苷對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是正常細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的自主、有序性死亡，受多種基因的調(diào)控，如Bcl-2、Bax、CyclinD1等〔14〕。凋亡相關(guān)基因的變化在細(xì)胞凋亡中起重要作用。Bcl-2基因表達(dá)量升高可抑制細(xì)胞的凋亡，是一種抑制凋亡的癌基因；Bax表達(dá)水平的升高可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，是一種促細(xì)胞凋亡基因〔15〕。 在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Bcl-2和Bax可形成二聚體而發(fā)揮作用〔16〕。CyclinD1是一種原癌基因，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化過(guò)程，通過(guò)與CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂從G1期向S期轉(zhuǎn)變，縮短細(xì)胞周期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖〔17〕。ROS參與細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的ROS含量處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體受到異常刺激時(shí)，如再灌注時(shí)機(jī)體內(nèi)的分子氧大量增加，ROS大量產(chǎn)生，超出機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)累積并釋放細(xì)胞毒，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18〕。所以ROS的產(chǎn)生是腦缺血再灌注損傷的一個(gè)重要過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷使星形膠質(zhì)細(xì)胞中ROS、Bax的含量顯著增加，Bcl-2、CyclinD1的表達(dá)量顯著降低，但人參皂苷可逆轉(zhuǎn)再灌注損傷的作用。

綜上，腦缺血再灌注損傷可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，但人參皂苷具有抗星形膠質(zhì)細(xì)胞再灌注損傷的作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。