高澤鑫，何臘平,2,*，劉亞兵，高 冰，李翠芹，劉涵玉

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

納豆起源于中國(guó)，是傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，唐朝時(shí)期傳入日本，有1 000 a以上食用歷史[1]。納豆類(lèi)似中國(guó)的豆豉，主要經(jīng)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵而來(lái)，日本將納豆作為營(yíng)養(yǎng)食品和調(diào)味品[2]，我國(guó)主要將豆豉用鍋蒸煮或炒后作為調(diào)味料。日本學(xué)者Sumi等[3]于1987年首次對(duì)納豆及其提取物作了系統(tǒng)研究，并找到了具有纖溶活性的納豆激酶。據(jù)報(bào)道，全球每年因患血栓類(lèi)疾病死亡的人數(shù)多達(dá)1 200萬(wàn)，而中國(guó)約占總數(shù)的1/5[4]，因此關(guān)于溶栓的藥物開(kāi)發(fā)成為了現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。由于納豆激酶具有高效溶栓作用，因此受到了各界的廣泛關(guān)注[5]。產(chǎn)納豆激酶菌株的來(lái)源有很多，如日本納豆食品中、一些海洋生物中、中國(guó)臺(tái)灣的土壤中、中國(guó)的豆豉和亞洲發(fā)酵蝦醬中[6-10]，也可能存在于傳統(tǒng)發(fā)酵的肉食品中。

食品中的生物胺主要通過(guò)微生物脫羧酶的作用生成含氮化合物[11]。口服攝入生物胺通常不會(huì)引起不良反應(yīng)，因?yàn)槿梭w腸道中有大量胺氧化酶能快速代謝含氮化合物，所以多數(shù)生物胺在人體中沒(méi)有直接的毒性[12]。然而，如果生物胺代謝能力過(guò)飽和或代謝活性被特異性抑制劑減弱，則可能發(fā)生食物中毒[13]。常見(jiàn)的中毒癥狀有惡心、呼吸困難、潮熱、出汗、神經(jīng)過(guò)敏、頭痛、明亮的紅色皮疹、口腔燒灼感、低滲或高血壓，這主要是由組胺、酪胺和β-苯乙胺引起[14]。據(jù)報(bào)道，在食品中組胺含量100 mg/kg被認(rèn)為是人類(lèi)食用的上限，而酪胺含量100～800 mg/kg和β-苯乙胺含量達(dá)到30 mg/kg是有毒劑量[15]。目前測(cè)定食品中生物胺含量的方法很多[16-17]，如毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法等，而本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)的方法來(lái)測(cè)定發(fā)酵納豆中生物胺的變化情況。

本研究通過(guò)酪蛋白平板和纖維蛋白平板篩選法從貴州織金特色農(nóng)家土制煙熏臘肉中分離出1 株高產(chǎn)納豆激酶菌株，并采用生理生化和分子生物學(xué)的方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定[18]。分離于傳統(tǒng)食品中的微生物一般不存在安全性問(wèn)題，但產(chǎn)納豆激酶的菌株一般會(huì)產(chǎn)生物胺。所以本研究在分離的菌株鑒定的基礎(chǔ)上，接著以黃豆為主要碳源，對(duì)其進(jìn)行純種固態(tài)發(fā)酵，檢測(cè)其在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生物胺的變化、產(chǎn)生的納豆激酶活力和生物量變化情況，探討菌株產(chǎn)生物胺的安全性問(wèn)題，為納豆的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 材料

黃豆為市售有機(jī)黃豆；菌株篩選樣品為貴州織金農(nóng)家土制煙熏臘肉。

1.1.2 試劑

牛凝血酶（1 000 U/g）、牛纖維蛋白原 沈陽(yáng)拜英生物技術(shù)有限公司；尿激酶生物標(biāo)準(zhǔn)品（1 240 IU/g）中國(guó)食品藥品檢定研究院；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：色胺、組胺、精胺、2-苯乙胺、腐胺、亞精胺、尸胺、酪胺、丹磺酰氯 美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：干酪素5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母膏1 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母提取物5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl5 g/L，pH 7；斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、酵母浸粉 2.5 g/L、葡萄糖1.0 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆清洗干凈，加入4 倍體積的去離子水浸泡，常溫浸泡18 h，瀝水后加入3%食鹽和3%蔗糖。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-10超凈工作臺(tái) 蘇州凈化有限公司；LS-B75L立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；DW-86L286立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SPX生化培養(yǎng)箱 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；HYG-A全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；S1000TM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Thermal Cycler公司；Gel Doc XR凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；TS-2102C恒溫振蕩器 上海天呈儀器有限公司；1100高效液相色譜儀及檢測(cè)器、SB-C18色譜柱 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆激酶活力測(cè)定

納豆激酶活力測(cè)定采用Astrup等[19]的方法，并對(duì)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品配制進(jìn)行改進(jìn)。將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品配制為248、496、744、992、1 240 IU/mL，各取10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白原平板孔中，放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃孵育18 h后取出，測(cè)定溶解圈的面積。以溶解圈的面積（mm2）為橫坐標(biāo)，以尿激酶活性為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的進(jìn)樣方法與標(biāo)準(zhǔn)品的方法相同，將孵育完的纖維蛋白原平板用游標(biāo)卡尺測(cè)定溶圈的直徑并計(jì)算各溶圈面積，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品納豆激酶活力。

1.3.2 高產(chǎn)納豆激酶菌株的篩選

將臘肉切碎制成樣品懸液用8.5%的生理鹽水10 倍梯度稀釋?zhuān)?0-7、10-8、10-9三個(gè)稀釋度涂布于酪蛋白平板上。由于納豆激酶是堿性絲氨酸蛋白酶，可水解酪蛋白形成透明圈，根據(jù)這一特性在37 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h后挑取出形態(tài)不同且有明顯水解透明圈的菌落，進(jìn)行純化后接種到斜面培養(yǎng)基上4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用接種環(huán)挑選2～3 環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌苔接種到液體種子培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后于4 ℃、12 000×g離心10 min。將粗酶液進(jìn)行納豆激酶活力測(cè)定。

1.3.3 菌株形態(tài)與生理生化鑒定

將篩選得到的酶活力最高的菌株在酪蛋白平板上畫(huà)線，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察單菌落形態(tài)，對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色正文，觀察菌體形態(tài)。根據(jù)文獻(xiàn)[20]對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。考察其對(duì)色氨酸、蔗糖、苦杏仁苷等的利用情況。

1.3.4 菌株分子鑒定

菌株活化后使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。擴(kuò)增使用的上游引物為27F，下游引物為1492R。25 μL反應(yīng)體系為模板DNA2 μL；27F 2.5 μL；1492R 2.5 μL；Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL；去離子水5.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火溫度從65 ℃降至55 ℃，每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃，退火時(shí)間為3 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；恒定退火溫度下進(jìn)行94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物送上海生工公司雙向測(cè)序，將雙向測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNA man軟件進(jìn)行拼接，再登錄NCBI將所得序列結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.5 納豆固態(tài)發(fā)酵

挑選顆粒飽滿、無(wú)畸形、色澤淡黃的市售有機(jī)黃豆，用去離子水沖洗，直至無(wú)雜物，豆水質(zhì)量比1∶4浸泡18 h后，瀝干水后分裝入三角瓶各50 g，再向每瓶加入1.5 g食鹽和1.5 g的蔗糖。放在高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮15 min，隨即放入超凈工作臺(tái)內(nèi)冷卻。挑取2～3 環(huán)菌苔接種到液體種子培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)18 h，然后按4%的接種量接種到冷卻好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)上，37 ℃培養(yǎng)72 h，每12 h搖晃一次。

1.3.6 固態(tài)發(fā)酵生物量與酶活力分析

在納豆固態(tài)發(fā)酵期間，每隔6 h取納豆樣品，稀釋涂布于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)18 h，統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算生物量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)重復(fù)。同時(shí)發(fā)酵期間每6 h測(cè)定納豆激酶活力。稱(chēng)取2 g納豆于10 mL離心管中加6 mL無(wú)菌的生理鹽水，4 ℃浸提24 h，用玻璃棒搗碎經(jīng)12 000×g離心10 min，上清液即為固態(tài)發(fā)酵粗酶液。

1.3.7 生物胺樣品前處理

將每隔6 h取的固態(tài)發(fā)酵剩余樣品用研缽研磨均勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g樣品置于50 mL離心管中，加入25 mL 0.4 mol/L高氯酸，振蕩提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。將沉淀如上述方法再加入25 mL高氯酸連續(xù)提取3 次，合并4 次上清液，最后用0.4 mol/L高氯酸定容至100 mL容量瓶。

1.3.8 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液制備與樣品衍生

生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制參照GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺含量的測(cè)定》[21]。取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL離心管中，依次加入100 μL2 mol/L氫氧化鈉溶液、150 μL飽和碳酸氫鈉溶液緩沖，再加入1 mL丹磺酰氯衍生劑（5 mg/mL，溶劑為丙酮），振蕩混勻后在避光條件下60 ℃水浴30 min，15 min時(shí)振蕩一次。加入50 μL 25%氨水終止衍生反應(yīng)，避光靜置30 min，加入700 μL乙腈溶液混勻，用0.22 μm有機(jī)濾頭過(guò)濾，于4 ℃避光保存，用于高效液相色譜測(cè)定。樣品溶液衍生的條件及方法與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同。

1.3.9 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為去離子水，流速為0.8 mL/min，采用的洗脫梯度見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)納豆激酶菌株的篩選

通過(guò)將煙熏臘肉樣品進(jìn)行稀釋涂布，再經(jīng)酪蛋白平板篩得18 株形態(tài)不同且有明顯透明圈的菌落，選取水解透明圈最大的7 株菌進(jìn)行純化。將純化好的7 株菌液態(tài)發(fā)酵，取上清粗酶液注入瓊脂糖-纖維蛋白原平板中，測(cè)定其溶圈面積，計(jì)算酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 高產(chǎn)納豆激酶菌株篩選結(jié)果Fig.1 Screening of high-yield nattokinase-producing strain

從圖1可以看出，GULR06的產(chǎn)酶能力最高，其液態(tài)發(fā)酵24 h后的納豆激酶活力達(dá)到（2 793±53）IU/mL。其次為GULR07活力達(dá)到（2 431±65）IU/mL。由此選定GULR06為納豆激酶高產(chǎn)菌株，進(jìn)行鑒定。

2.2 高產(chǎn)菌形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

圖2 GULR06的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色圖（B）Fig.2 Colony (A) and Gram-staining (B) of strain GULR06

由圖2A可知，GULR06菌落在酪蛋白平板上形成圓形、低凹起、有黏性的小菌落，其顏色呈乳白色，邊緣規(guī)則，無(wú)光澤，稍隆起，不透明，菌落直徑2.0～2.9 mm。該菌株革蘭氏染色菌體為紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列，芽孢中生或近中生，初步判斷為芽孢桿菌屬，其革蘭氏染色菌體形態(tài)見(jiàn)圖2B。

對(duì)菌株GULR06進(jìn)行部分生理生化特征實(shí)驗(yàn)。該菌株不能發(fā)酵半乳糖、乳糖、衛(wèi)茅醇、松叁糖、巖糖、塔格糖、鼠李糖，阿東醇、阿拉伯糖醇和木糖醇，同時(shí)不能與色氨酸發(fā)生發(fā)應(yīng)。參照文獻(xiàn)[20]對(duì)枯草芽孢桿菌的描述，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌，菌株GULR06的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株GULR06的生理生化鑒定結(jié)果Table2 Identif i cation of strain GULR06

2.3 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段送上海生工基因公司雙向測(cè)序，將雙向測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNA man軟件進(jìn)行拼接后顯示GULR06菌株16S rDNA全長(zhǎng)為1 461 bp。BLAST分析結(jié)果顯示該基因同枯草芽孢桿菌的16S rDNA基因相似度達(dá)到100%。通過(guò)MEGA 5.0軟件與同屬親緣關(guān)系較近的模式菌株進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3所示。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明，該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以萊西式菌FJ426598作為一個(gè)單獨(dú)的外群種，其中GULR06菌株與枯草芽孢桿菌KY123872.1菌株在同一分支，結(jié)合前面的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，最后鑒定GULR06為枯草芽孢桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列同源性的菌株GULR06的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain GULR06

2.4 納豆發(fā)酵中生物量變化及產(chǎn)酶特性

圖4 納豆發(fā)酵中菌株生物量及納豆激酶活力的變化Fig.4 Changes in biomass and nattokinase biosynthesis during natto fermentation

如圖4所示，將菌株GULR06用于納豆固態(tài)發(fā)酵，表現(xiàn)出了細(xì)菌生長(zhǎng)的一般規(guī)律，從生物量曲線上可以看出，0～12 h內(nèi)為延滯期，該階段時(shí)間較短；12～42 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)由8.53（lg（CFU/g））增加至14.03（lg（CFU/g）），此階段菌株GULR06大量繁殖，在42 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到固態(tài)發(fā)酵中的最高值；42～48 h內(nèi)是穩(wěn)定期；48 h之后是衰亡期。由納豆激酶相對(duì)活力變化曲線可以發(fā)現(xiàn)，隨著菌體生長(zhǎng)，納豆激酶才被逐漸合成。54 h時(shí)，納豆激酶活力達(dá)到最高，為（5 439.5±149）IU/g，此時(shí)活菌數(shù)已降至13（lg（CFU/g））。54 h以后，納豆激酶活力逐漸降低，這可能是在衰亡期的菌株GULR06代謝出具有能夠降解納豆激酶的物質(zhì)造成的。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)篩選產(chǎn)納豆激酶菌株酶活力的報(bào)道多數(shù)為100～3 000 IU/g，另外有部分較高納豆激酶活力的報(bào)道為3 000～5 000 IU/mL[22-25]。本研究所分離菌株GULR06的納豆激酶活力顯著高于大多的報(bào)道，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

2.5 生物胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜分析及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of mixed standard of biogenic amines

如圖5所示，8 種生物胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)品在25 min內(nèi)能全部出峰，出峰前后順序分別為色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。其中，色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺的保留時(shí)間分別為5.129、10.173、12.305、13.338、14.500、15.517、19.777、21.144 min，分離度都大于1，由此可見(jiàn)各種生物胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)品能有效分離。

圖6 納豆樣品中生物胺的高效液相色譜圖Fig.6 Chromatogram of biogenic amines in natto sample

由圖6可知，納豆樣品中生物胺在液相色譜上分離效果較好，可由生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的保留時(shí)間來(lái)確定樣品的生物胺。

表3 高效液相色譜法測(cè)定生物胺的特征指標(biāo)及其精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Calibration equations, correlation efcient and precision(relative standard deviation) for biogenic amines

表3 高效液相色譜法測(cè)定生物胺的特征指標(biāo)及其精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Calibration equations, correlation efcient and precision(relative standard deviation) for biogenic amines

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品 回歸方程 相關(guān)系數(shù)（R2） 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%色胺 y=18.051x-15.468 0.999 78 0.89 2-苯乙胺 y=20.971x-1.246 0.999 88 0.21腐胺 y=27.778x-7.373 6 0.999 80 0.47尸胺 y=43.326x+20.636 0.995 09 1.03組胺 y=38.565x-51.726 0.994 43 2.58酪胺 y=40.162x-58.508 0.995 47 3.26亞精胺 y=49.351x-1.9144 0.999 92 0.65精胺 y=62.635x-8.0793 0.999 98 0.56

由表3可見(jiàn)，8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均大于0.994 0，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，能滿足檢測(cè)樣品中生物胺的要求。對(duì)質(zhì)量濃度為80 mg/L的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)進(jìn)樣6 次，8 種生物胺的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.21%～3.26%，均小于4%，說(shuō)明該液相色譜具有良好的精密度，方法重復(fù)性也較好。

2.6 納豆發(fā)酵過(guò)程中生物胺的含量變化

表4 納豆發(fā)酵中生物胺含量Table4 The contents of biogenic amines in natto products

納豆發(fā)酵過(guò)程中的生物胺含量見(jiàn)表4，從不同發(fā)酵時(shí)間的納豆樣品中共檢測(cè)出8 種生物胺，只有尸胺、2-苯乙胺、精胺和酪胺在部分發(fā)酵時(shí)間中未能檢測(cè)出。在發(fā)酵過(guò)程中不同生物胺的產(chǎn)量均有差異，其中色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺和生物胺總量在納豆發(fā)酵過(guò)程中的含量范圍分別為12.51～30.06、ND～10.56、2.34～4.63、ND～1.02、1.52～1.80、ND～16.53、6.64～11.61、ND～4.42、26.47～72.97 mg/kg。從表4可以看出，除了色胺、2-苯乙胺、酪胺和亞精胺的生物胺含量上升外，其他的生物胺含量都保持不變或緩慢的下降，但生物胺總量由于色胺和酪胺較大幅度升高而上升。有報(bào)道指出，酪胺和尸胺能夠抑制腸道中組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶和二胺氧化酶的活性，從而增強(qiáng)組胺對(duì)機(jī)體的毒性[26]。同時(shí)尸胺和腐胺可以同亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)生成致癌物質(zhì)亞硝胺，并能黏附一些腸黏膜上的腸道致病菌對(duì)機(jī)體構(gòu)成危害[27-28]。另外，由于發(fā)酵食品中生物胺的形成不僅與原料選擇和加工條件相關(guān)，同時(shí)也跟發(fā)酵過(guò)程中的微生物聯(lián)系緊密，因此生物胺含量的高低也可被視為發(fā)酵過(guò)程中微生物污染的重要指標(biāo)。

在整個(gè)納豆發(fā)酵過(guò)程中，生物胺總量的變化趨勢(shì)是隨著時(shí)間推移而緩慢的增加。其中，在發(fā)酵0～12 h過(guò)程中生物胺總量有一定的下降，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于該時(shí)段為納豆發(fā)酵時(shí)的延滯期，菌株GULR06在適應(yīng)固態(tài)發(fā)酵環(huán)境，菌株緩慢開(kāi)始生長(zhǎng)，生物胺的代謝也剛開(kāi)始進(jìn)行，導(dǎo)致總生物胺的產(chǎn)生量低于總生物胺的揮發(fā)量，因而在此階段生物胺的總量緩慢下降。在12～72 h的生物胺總量總體呈上升趨勢(shì)，只有42～48 h中有一定的下降，這是由于該階段為菌株的衰亡期，菌株大量死亡或生長(zhǎng)畸形，生理代謝活動(dòng)趨于停滯，而生物胺緩慢揮發(fā)導(dǎo)致此階段生物胺總量下降。有研究表明，人體攝入生物胺總量超過(guò)1 000 mg/kg時(shí)會(huì)嚴(yán)重危害健康[29]。而由圖7可以看出，本實(shí)驗(yàn)采用的枯草芽孢桿菌GULR06純種進(jìn)行納豆發(fā)酵的各時(shí)段生物胺總量均小于80 mg/kg，遠(yuǎn)低于報(bào)道的危害人體健康的生物胺總量。有調(diào)查顯示[30]，25%的日本人每天食用100～200 g納豆，以納豆樣品中檢測(cè)的生物胺總量進(jìn)行估算，應(yīng)不存在安全問(wèn)題，因而具有很大的商業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。結(jié)合圖4的納豆發(fā)酵中納豆激酶的合成曲線，可發(fā)現(xiàn)在用枯草芽孢桿菌GULR06進(jìn)行納豆發(fā)酵時(shí)，納豆激酶相對(duì)活力在54 h時(shí)達(dá)到最大，為（5 439.5±149）IU/g，而在此時(shí)間生物胺總量為（56.18±4.94）mg/kg。以生產(chǎn)安全和納豆激酶活力的角度而言，采用枯草芽孢桿菌GULR06進(jìn)行納豆生產(chǎn)時(shí)應(yīng)在發(fā)酵到54 h時(shí)終止反應(yīng)。

圖7 納豆發(fā)酵中生物胺總量變化曲線Fig.7 Changes in biogenic amines contents during natto fermentation

3 結(jié) 論

本研究采用纖溶活性篩選法從貴州織金農(nóng)家土制煙熏臘肉中分離篩選出一株高產(chǎn)納豆激酶菌株GULR06，對(duì)菌株的菌株形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定得到該菌株為枯草芽孢桿菌。用黃豆為主要原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制備納豆，通過(guò)高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的生物胺進(jìn)行檢測(cè)，得到在25 min內(nèi)尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、酪胺、亞精胺、組胺在都能得到很好的分離，線性關(guān)系良好，R2均大于0.994 0，重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%。在納豆發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)人體危害較大的2-苯乙胺、酪胺、組胺的含量均沒(méi)有超過(guò)危險(xiǎn)值，且生物胺總量范圍在26.47～72.97 mg/kg之間，遠(yuǎn)低于人體攝入生物胺總量，所以本研究生產(chǎn)的納豆不存在生物胺的食用安全性問(wèn)題。

同時(shí)結(jié)合研究了發(fā)酵過(guò)程中納豆激酶活力和生物量的變化。發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵到54 h時(shí)，納豆激酶活力達(dá)到最高，為（5 439.5±149）IU/g，活菌數(shù)為13（lg（CFU/g）），此時(shí)生物胺總量為（56.18±4.94）mg/kg。以納豆安全性和酶活力得率的角度，得到了用枯草芽孢桿菌GULR06進(jìn)行納豆生產(chǎn)時(shí)應(yīng)在發(fā)酵到54 h時(shí)終止反應(yīng)。由于本研究所制備的納豆具有高纖溶活性和安全性好的優(yōu)點(diǎn)，因而對(duì)納豆食品的研發(fā)和食品安全的控制都有很好的指導(dǎo)意義。