胡青青，周恩敏，金克，杜勇，錢燕，翁華春

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，浙江 溫州 325015）

肺纖維化是許多急性和慢性肺病的常見終末期后遺癥，是一種進(jìn)行性肺病[1]。盡管近年來肺纖維化的治療有所進(jìn)展，但大多數(shù)患者仍然面臨病死的結(jié)果，目前唯一的治愈性治療是肺移植[2]。因此，對肺纖維化機制進(jìn)一步研究并尋找合適的治療靶點是必要的。褪黑素由松果體等器官合成，廣泛分布于生物體內(nèi)[3]。研究表明，褪黑素具有抗氧化、抗癌以及免疫調(diào)節(jié)作用[4]。YEUNG等[5]研究表明，褪黑素可以抑制慢性間歇性缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷大鼠纖維化標(biāo)志物的表達(dá)，如TGF-β。DAS等[6]報道褪黑素干預(yù)可以消除脂毒性介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化并防止肝纖維化進(jìn)展。但是目前關(guān)于褪黑素對肺纖維化的作用尚未見相關(guān)報道，本研究旨在探討褪黑素對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 博來霉素粉劑由日本化藥株式會社生產(chǎn)，規(guī)格15 mg/支，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供；褪黑素購自美國Sigma公司；氧化應(yīng)激試劑盒購自南京建成公司；本實驗所使用反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR相關(guān)試劑均購自大連TaKaRa公司；RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）引物由深圳華大基因公司合成；單克隆抗小鼠E-cadherin抗體、單克隆抗小鼠α-SMA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG購自上海碧云天生物公司；免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組：雄性SPF級C57BL/6小鼠30只，6周齡，20 g左右，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。用博來霉素（5.0 mg/kg）氣管內(nèi)注射制作大鼠肺纖維化模型[7]。隨機分為模型組和褪黑素組，每組15只。褪黑素組腹腔注射5.0 mg/kg褪黑素，模型組腹腔注射同等體積的0.9%氯化鈉溶液。4周后處死小鼠，提取肺組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。本研究動物實驗方案由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 HE染色評估肺組織病理改變：將肺組織進(jìn)行固定并常規(guī)石蠟包埋，將從肺組織的不同部位收集的3個組織塊切片至5 μm的厚度。HE染色按照試劑盒說明書操作，用來評估肺組織的病理變化（肺泡炎和肺纖維化）。

1.2.3 肺組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量測定：將肺組織用0.9%氯化鈉溶液在冰上勻漿，然后在4 ℃以4 000 r/min離心10 min。上清液用于進(jìn)一步測量。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用檢測試劑盒檢測。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測肺組織中α-SMA和E-cadherin表達(dá)：將肺組織固定并常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約5 μm。切片脫蠟至水，用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%雙氧水滅活內(nèi)源性氧化酶，加入一抗（1:100）孵育后，加入二抗繼續(xù)孵育，用DAB溶液進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染后封片。視野下棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，觀察蛋白在肺組織中的表達(dá)情況。

1.2.5 RT-PCR檢測肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-6以及α-SMA和E-cadherin mRNA的表達(dá)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的擴增。TNF-α引物上游：5’-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3’，下游：5’-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3’；IL-6引物上游：5’-TGTGCAATGGCAATTCTGAT-3’，下游：5’-GGTACTCCAG AAGACCAGAGGA-3’；α-SMA引物上游：5’-GCACAGCTTCT CCTTGATGTC-3’，下游：5’-CCGAGATCTCACCGACCT-3’；E-cadherin引物上游：5’-AAACCTGATGGATGTGGGATG-3’，下游：5’-GGTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3’；以GAPDH作為內(nèi)參，引物上游：5’-AACGACCCCTTCATTGACCT-3’，下游：5’-CACCAGTAGACTCCACGACA-3’。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃60 s，40個循環(huán)，各設(shè)置3個重復(fù)孔，結(jié)果以2-△△Ct方法分析細(xì)胞基因表達(dá)差異。

1.2.6 Western blot檢測肺組織中α-SMA和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平：提取肺組織剪碎后放入液氮進(jìn)行研磨，加入500 μL蛋白裂解液繼續(xù)研磨，離心取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。加樣，經(jīng)電泳蛋白分離和轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗孵育（1:1 000），4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗（1:5 000）常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，經(jīng)Quantity One進(jìn)行灰度測量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色評估博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型肺組織病理改變 HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型組小鼠肺組織肺泡滲出物減少，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞；間質(zhì)間隙明顯擴大，細(xì)胞外基質(zhì)增生明顯；在肺間質(zhì)中也觀察到成纖維細(xì)胞增殖，并且膠原纖維的積聚形成了廣泛的纖維化。與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織肺泡腔和肺間質(zhì)中可見炎性細(xì)胞浸潤，肺間隔增厚，肺間質(zhì)中可見少量膠原纖維結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 2組小鼠肺組織病理形態(tài)改變（HE，×200）

2.2 2組肺組織氧化應(yīng)激水平及炎癥因子表達(dá) 氧化應(yīng)激檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織SOD活性顯著升高（P＜0.05）；與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織MDA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 2組肺組織氧化應(yīng)激水平及炎癥因子表達(dá)（n=15，±s）

表1 2組肺組織氧化應(yīng)激水平及炎癥因子表達(dá)（n=15，±s）

與模型組比：aP＜0.05

組別 SOD（U/mg） MDA（nmol/g） TNF-α mRNA IL-6 mRNA模型組 7.30±0.80 441.1±13.7 2.78±0.86 3.56±1.24褪黑素組 13.90±1.00a 252.6± 9.7a 1.43±0.27a 1.06±0.38a

2.3 肺組織中α-SMA和E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)水平 RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織α-SMA mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），E-cadherin mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見表2。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織α-SMA蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見圖2。

2.4 褪黑素降低肺纖維化肺組織中α-SMA和增加E-cadherin表達(dá) α-SMA蛋白主要分布在肺間質(zhì)基質(zhì)和成纖維細(xì)胞中，E-cadherin蛋白主要分布在肺泡上皮細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織α-SMA蛋白表達(dá)量顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高，見圖3。

表2 2組肺組織中α-SMA和E-cadherin mRNA的表達(dá)水平（n=15，±s）

表2 2組肺組織中α-SMA和E-cadherin mRNA的表達(dá)水平（n=15，±s）

與模型組比：aP＜0.05

組別 α-SMA E-cadherin模型組 1.34±0.21 0.83±0.12褪黑素組 1.03±0.15a 1.13±0.19a

3 討論

肺纖維化是以纖維化病灶和炎癥浸潤為特征的致命性肺部疾病。纖維化可發(fā)生在氣道壁上，如哮喘中較大的氣道和慢性阻塞性肺疾病小氣道周圍或肺實質(zhì)[8]，會導(dǎo)致肺實質(zhì)瘢痕形成和肺功能逐漸下降，最終導(dǎo)致呼吸衰竭[9]。闡明纖維化的發(fā)生和發(fā)展的分子機制和過程，有助于開發(fā)新的有效治療方法。

圖2 Western blot檢測α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)

圖3 免疫組織化學(xué)檢測α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)（×200）

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是參與肺纖維化進(jìn)展的重要分子機制[10]。已有相關(guān)研究表明肺纖維化和炎癥因子反應(yīng)緊密相關(guān)[11]。IL-6水平降低可以使小鼠肺纖維化減弱[12]。TNF-α可以誘導(dǎo)NF-κB激活促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)展[13]。CHEN等[14]的研究報道龍膽苦苷能抑制炎癥和纖維蛋白形成的過程，改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。褪黑素主要由松果體在夜間合成并分泌[15]，是一種不依賴受體的自由基清除劑，具有強效的抗氧化和抗炎特性[16]。ZHAO等[17]研究表明褪黑素通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。KARIMFAR等[18]研究報道褪黑素可以通過抑制環(huán)氧合酶-2的表達(dá)，減弱博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。與上述文獻(xiàn)報道相一致，本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以使肺纖維化組織SOD表達(dá)量顯著升高，MDA表達(dá)量顯著降低，降低肺纖維化組織TNF-α、IL-6表達(dá)量，抑制肺纖維化小鼠氧化應(yīng)激和炎癥因子水平。

纖維增殖性疾病的特征在于α-SMA的表達(dá)量增加[19]，E-cadherin是上皮細(xì)胞黏附和表型的主要標(biāo)志，其減少和丟失是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，進(jìn)而導(dǎo)致纖維化形成[20]。博來霉素是臨床上一種有效的抗癌藥物，主要用于治療生殖細(xì)胞瘤和淋巴瘤，但是其通過誘導(dǎo)肺組織氧化應(yīng)激和促進(jìn)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺纖維化[21]。YOU等[7]報道博來霉素腹腔注射可誘導(dǎo)小鼠肺纖維化。本研究HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺組織肺泡滲出物減少，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞；此外，間質(zhì)間隙明顯擴大，細(xì)胞外基質(zhì)增生明顯。與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織肺泡腔和肺間質(zhì)中可見炎性細(xì)胞浸潤，肺間隔增厚，肺間質(zhì)中可見少量膠原纖維結(jié)構(gòu)，提示博來霉素成功誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，褪黑素可以抑制肺纖維化進(jìn)展。進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)、RT-PCR以及Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褪黑素抑制α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)。提示褪黑素可以通過調(diào)控α-SMA和E-cadherin表達(dá)抑制肺纖維化進(jìn)展。

綜上所述，褪黑素通過降低氧化應(yīng)激和炎癥因子水平，抑制α-SMA蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，延緩肺纖維化進(jìn)展。