葉曉鮮，毛珊珊，宋易玲，王路得，蔣朋飛，朱珊麗，張麗芳

（溫州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第2位[1]，嚴(yán)重影響了女性的健康與生命。研究表明，HPV高危型別（16、18、31、33、58、52等）感染與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其中HPV16與HPV18型為全球感染的主要型別，而HPV58型是亞洲人中普遍高危感染HPV型別之一，尤其在我國，僅次于HPV16和18型[2]。

HPV高危型別致癌的主要機(jī)制是其腫瘤源性蛋白E6和E7。E6蛋白在宮頸上皮細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通過介導(dǎo)腫瘤抑制基因p53的泛素化降解，誘導(dǎo)和保持宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，而高表達(dá)E7蛋白及其產(chǎn)物則通過作用于pRB及E2F-1，促進(jìn)S期相關(guān)蛋白表達(dá)，使細(xì)胞不斷增殖并發(fā)生癌變[3]。目前，基于HPV16、18、31、33、52、58等高危型別L1蛋白的病毒樣顆粒九價(jià)疫苗已經(jīng)上市，成功地用于預(yù)防由高危型HPV感染導(dǎo)致的宮頸癌，然而該疫苗在對高危HPV各型病毒感染的治療上沒有效果。關(guān)于HPV58型致病機(jī)制的研究相對還是比較滯后，而E7蛋白相關(guān)作用的研究報(bào)道已有很多，因此，本研究以HPV58型E6蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，借助計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)軟件，對其B細(xì)胞表位及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測與分析，為進(jìn)一步研究HPV58型E6蛋白的生物學(xué)特性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 HPV58型E6蛋白的氨基酸序列 從瑞士生物信息研究所的Swissprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索到E6蛋白氨基酸序列。

1.2 HPV58型E6蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析預(yù)測E6蛋白的二級結(jié)構(gòu)分別采用expasy（http://www.expasy.org/proteomics/）在線服務(wù)器中的GOR[4]與SOPMA軟件[5]。分析預(yù)測E6蛋白的三級結(jié)構(gòu)采用expasy在線服務(wù)器中的SWISS-MODEL軟件。

1.3 HPV58型E6蛋白的跨膜區(qū)域 分析預(yù)測E6蛋白的跨膜區(qū)域分別采用expasy在線服務(wù)器中的TMPRED與PROTSCALE軟件。

1.4 HPV58型E6蛋白的親水性、表面可及性、抗原性、極性與柔韌性參數(shù)預(yù)測 分析預(yù)測E6蛋白的HOOP&WOODS親水性[6]、Janin表面可及性、Jameson-Wolf抗原性、Zimmerman極性[7]與柔韌性采用expasy在線服務(wù)器PROSCALE與DNASTAR軟件。

1.5 綜合分析 綜合以上參數(shù)分析HPV58型E6蛋白B細(xì)胞表位的優(yōu)勢位點(diǎn)，并采用吳玉章等[8]建立的抗原性指數(shù)（antigenic index，AI）綜合推斷HPV58型E6蛋白B細(xì)胞的優(yōu)勢表位。

2 結(jié)果

2.1 HPV58型E6蛋白的氨基酸序列與理化性質(zhì) E6蛋白由149個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為17.7937 ku，初步推斷分子式為C782H1255N233O218S12，等電點(diǎn)（theoretical pI）為9.10，不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為60.99，疏水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.517，數(shù)據(jù)說明為親水性蛋白。氨基酸序列見圖1。

圖1 HPV58型E6蛋白的氨基酸序列（P26555）

2.2 HPV58型E6蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 GOR與SOPMA軟件預(yù)測E6蛋白二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果無顯著差別，均表明E6蛋白柔性區(qū)域以無規(guī)則卷曲為主，少見轉(zhuǎn)角，33.56% α-螺旋（alpha helix，Hh）、17.45% β-片層（extended strand，Ee）、48.99%無規(guī)則卷曲（random coil，Cc）構(gòu)成，見圖2。SWISS-MODEL軟件預(yù)測HPV58型E6蛋白的空間結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖2 HPV58型E6蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖3 HPV58型E6蛋白的三維結(jié)構(gòu)

2.3 HPV58型E6蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測 TMPRED與PROTSCALE軟件分析E6蛋白的跨膜區(qū)域顯示，E6蛋白幾乎無跨膜區(qū)域，為可溶性蛋白，圖4顯示疏水峰值和親水峰值的氨基酸分別占所含氨基酸的百分率，親水值大于0的氨基酸所占的比例超過50%，可認(rèn)為氨基酸合成的整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出親水性，反之為疏水性。

圖4 HPV58型E6蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測

2.4 HPV58型E6蛋白的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原性與極性參數(shù)預(yù)測 應(yīng)用HOPP-WOODS預(yù)測親水性參數(shù)，Zimmerman預(yù)測極性參數(shù)與柔韌性參數(shù)，DNASTAR中的protean預(yù)測抗原性與表面可及性參數(shù)，結(jié)果顯示肽段8～15、27～44、108～127、141～147為可能的B細(xì)胞線性表位。見圖5、表1。

圖5 HPV58型E6蛋白的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原性與極性參數(shù)預(yù)測

2.5 HPV58型E6蛋白的綜合分析與AI 選擇可能的線性B細(xì)胞肽段位置（8～15、27～44、108～127、141～147），計(jì)算HPV58型E6蛋白B細(xì)胞可能的表位區(qū)段AI，結(jié)果見表2。這些肽段均顯示出較好的親水性、柔韌性、表面可及性及抗原性，在二級結(jié)構(gòu)上易于形成無規(guī)則卷曲與轉(zhuǎn)角，初步推斷可能為E6蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。

2.6 HPV58型E6蛋白B細(xì)胞表位同源性匹配分析 應(yīng)用在線軟件protein blast分析B細(xì)胞表位的氨基酸序列的同源性，HPV58型E6蛋白N端第8～15、108～127肽段的氨基酸序列不僅與HPV58型E6蛋白的氨基酸序列為100%同源性，在HPV型別中也與HPV9型E6蛋白、HPV33型E6蛋白同源性達(dá)100%，第27～44、141～147肽段的氨基酸序列在HPV型別中只與HPV58型E6蛋白同源性達(dá)100%，見表2。

3 討論

B表位是抗原蛋白質(zhì)表面具有特殊結(jié)構(gòu)與免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，可被B細(xì)胞表面受體或抗體Fab部分特異性識別并結(jié)合。在特異性免疫應(yīng)答中，抗原經(jīng)抗原提呈細(xì)胞加工處理后，向細(xì)胞表面抗原受體提呈線性抗原片段，并特異性結(jié)合，誘發(fā)免疫反應(yīng)。嚴(yán)格來說，抗原并不是通過其完整分子來發(fā)揮作用，抗體的特異性通常是針對表位來實(shí)現(xiàn)的[9]。表位作為抗原的核心部分，通常由5～7個(gè)相鄰連續(xù)氨基酸殘基組成，一般不超過20個(gè)氨基酸殘基[10]。隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)與生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，B細(xì)胞線性表位預(yù)測研究進(jìn)入不斷標(biāo)準(zhǔn)化與廣泛性應(yīng)用，應(yīng)用特殊性軟件對表位進(jìn)行預(yù)測與分析，篩選出B細(xì)胞線性表位的優(yōu)勢肽段，這種采用免疫信息學(xué)方法進(jìn)行抗原表位預(yù)測，不僅加速新表位的發(fā)現(xiàn)及研究，而且降低實(shí)驗(yàn)室費(fèi)用。有關(guān)HPV各種型別蛋白的B表位預(yù)測的文獻(xiàn)報(bào)道有很多，如HPV58型E7、HPV16型L1及HPV16、18、33、52、58五種高危型E7蛋白的B細(xì)胞線性表位的預(yù)測[11-13]。本實(shí)驗(yàn)室也已開展了B線性表位預(yù)測的工作，如HPV16型E6蛋白，沙眼衣原體Tarp、HPV58型L1蛋白及程序性死亡受體配體-1等的B表位預(yù)測及分析[14-17]，由此獲得可能的B細(xì)胞表位后，經(jīng)免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體血清，驗(yàn)證可以特異性識別天然抗原，因此，進(jìn)一步證明通過生物信息學(xué)能準(zhǔn)確預(yù)測特異性蛋白的B細(xì)胞線性表位。從HOOP等[18]提出以親水性方案對抗原表位進(jìn)行預(yù)測以來，不同預(yù)測方法的發(fā)表及發(fā)展推動(dòng)了B細(xì)胞線性表位的廣泛應(yīng)用。目前被公認(rèn)及廣泛應(yīng)用的預(yù)測方法為二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、可及性、可塑性及電荷分布方法這6種方法[19]。上述各種預(yù)測方法均存在誤差，應(yīng)綜合運(yùn)用以上參數(shù)進(jìn)行預(yù)測。首先分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及表位分布的關(guān)系，無規(guī)則卷曲與β-轉(zhuǎn)角出現(xiàn)頻率高代表表位易于在這段氨基酸區(qū)域形成，其中無規(guī)則卷曲易于盤旋，扭轉(zhuǎn)，而蛋白骨架含有β-轉(zhuǎn)角的則完全倒轉(zhuǎn)方向，形成β-轉(zhuǎn)角的殘基以氫鍵相互緊聚，從而暴露在蛋白表面而突出，形成結(jié)構(gòu)多樣且易于嵌合的抗原識別點(diǎn)，然后應(yīng)用DNASTAR軟件進(jìn)行分析B細(xì)胞表位的親水性、柔韌性、表面可及性及極性，結(jié)合AI計(jì)算法綜合預(yù)測，暴露在膜外的區(qū)域代表親水性高，增加與抗體嵌合的概率，結(jié)構(gòu)易于變換代表柔韌性好，與抗體易于嵌合代表表面可及性好，綜合以上數(shù)據(jù)，把符合AI高的氨基酸序列進(jìn)行蛋白同源性匹配分析，篩選出的蛋白同源性少的氨基酸序列為可能的B細(xì)胞表位。

本研究按照上述順序進(jìn)行分析，應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測了HPV58型E6蛋白的B細(xì)胞表位，篩選出8～15、27～44、108～127、141～147這4段肽段為可能的B細(xì)胞線性表位，并進(jìn)行在線軟件BLAST同源性匹配分析，發(fā)現(xiàn)肽段8～15、108～127也與HPV型別中的HPV33型E6、HPV9型E6蛋白同源性匹配為100%，肽段27～44、141～147僅見于HPV58型E6蛋白的B細(xì)胞。與其他蛋白同源性100%出現(xiàn)頻率越低，意味著肽段成為B細(xì)胞表位的特異性越強(qiáng)，因此8～15、108～127肽段不適合進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究，最終得到肽段27～44（ELKCVECKKTLQRSEVYD）、141～147（RPRRRQT）為可能的特異性B細(xì)胞線性表位。

表1 應(yīng)用不同方法預(yù)測HPV58型E6蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

表2 HPV58型E6蛋白B細(xì)胞表位優(yōu)勢區(qū)域的平均AI