周俊杰，吳實(shí)正，段鵬凱，袁媛，何璇，童華生

膿毒癥是由感染導(dǎo)致的臟器功能不全，在ICU中具有較高病死率[1]，其病理機(jī)制不僅限于病原微生物對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷，同時(shí)也是機(jī)體的一種“失控的自主反應(yīng)”[2-3]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的天然免疫細(xì)胞，在病原菌的吞噬和消化過(guò)程中具有重要作用。目前一些研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞釋放的大量炎癥介質(zhì)是膿毒癥狀態(tài)下造成臟器損傷的重要原因[4]。2001年被首次提出的細(xì)胞焦亡[5](pyroptosis)是一種半胱天冬酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1)依賴性細(xì)胞死亡方式[6]，是主要發(fā)生于巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的炎癥性細(xì)胞死亡，伴隨有大量炎癥介質(zhì)的釋放。這種大量炎癥介質(zhì)釋放的表現(xiàn)提示其可能與膿毒癥過(guò)程中的過(guò)度炎癥反應(yīng)相關(guān)。烏司他丁(ulinastatin，UTI)是一種蛋白酶抑制劑[7]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均提示其可降低膿毒癥動(dòng)物/患者循環(huán)血液中炎癥介質(zhì)的水平，具有良好的抗炎作用[8-10]，但具體機(jī)制尚不完全明確。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/尼日利亞菌素(nigericin)聯(lián)合刺激骨髓源性巨噬細(xì)胞構(gòu)建體外巨噬細(xì)胞焦亡模型，探討烏司他丁對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的作用及其可能的抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)購(gòu)自美國(guó)MP公司，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α檢測(cè)試劑盒及乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，IL-18檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司?？拱腚滋於?1(caspase-1)及Gasdermin D蛋白(GSDMD)一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，二抗購(gòu)自上海Absin公司。UTI購(gòu)自廣東天普公司，RT-qPCR引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.2 骨髓源性巨噬細(xì)胞分離及培養(yǎng) C57BL/6小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8～10周齡，體重20～25g。頸椎脫臼法處死小鼠，沿股骨上段和脛骨下端關(guān)節(jié)處將股骨和脛骨剪斷取出；在距離骨髓腔末2mm處切除股骨和脛骨的兩端，使骨髓腔充分暴露；將1ml注射器針頭插入暴露的骨髓腔內(nèi)，完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至白色狀態(tài)，收集骨髓沖洗液，離心去上清，用含有10ng/ml小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，MCSF)的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪于6孔板，置于37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，每次換液時(shí)MCSF濃度加倍。小鼠巨噬細(xì)胞在第6天分化完畢，第7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞焦亡模型的建立及UTI預(yù)處理 按照文獻(xiàn)[11]方法采用LPS/尼日利亞菌素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞構(gòu)建巨噬細(xì)胞焦亡模型。將細(xì)胞分為對(duì)照組、UTI組、模型組和模型+UTI組，其中，UTI組和模型+UTI組在建模前給予1000U/ml UTI預(yù)處理，其余兩組給予等量PBS。模型組和模型+UTI組先用LPS 100ng/ml刺激培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞4h，再加入10μmol/L尼日利亞菌素繼續(xù)刺激2h，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)；對(duì)照組及UTI組在此期間僅給予等體積PBS，在相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96孔板中，按上述方法刺激后，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入0.5mg/ml的MTT溶液150μl，37℃避光孵育4h，去上清，每孔加入DMSO溶液150μl，結(jié)晶物充分溶解后應(yīng)用酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)量各孔吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率=各組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5 分光光度法檢測(cè)細(xì)胞LDH釋放率 收集各組細(xì)胞上清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)釋放出的LDH，裂解剩余的貼壁細(xì)胞檢測(cè)LDH，兩者之和即為總LDH。LDH釋放率=上清LDH含量/總LDH含量×100%。

1.6 Western blotting檢測(cè)caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，按常規(guī)步驟進(jìn)行Western blotting分析，檢測(cè)細(xì)胞caspase-1、GSDMD表達(dá)及活化情況，結(jié)果圖采用Image J進(jìn)行灰度分析。

1.7 細(xì)胞上清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6蛋白水平檢測(cè) 收集細(xì)胞上清，采用ELISA測(cè)定各因子水平，顯色反應(yīng)終止后，使用酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)各孔OD值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6濃度。

1.8 細(xì)胞IL-1β、IL-18 mRNA水平檢測(cè) 采用RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β、IL-18 mRNA水平，各目的基因引物序列見(jiàn)表1。按照文獻(xiàn)[12]方法通過(guò)2–ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，在滿足方差齊性的條件下，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RT-qPCR分析所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers (RT-qPCR analysis)

2 結(jié) 果

2.1 UTI預(yù)處理對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細(xì)胞存活率及LDH釋放率的影響 MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，經(jīng)LPS/尼日利亞菌素作用后，模型組巨噬細(xì)胞存活率下降至73.40%，給予UTI預(yù)處理后，存活率上升(73.40%vs.86.30%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1A)。經(jīng)LPS/尼日利亞菌素聯(lián)合刺激后，LDH釋放明顯增加。給予UTI預(yù)處理后，LDH釋放率明顯下降(22.45%vs.14.80%，P＜0.05，圖1B)。

2.2 UTI預(yù)處理對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用后巨噬細(xì)胞caspase-1活化、GSDMD片段化的影響 Western blotting結(jié)果顯示，LPS/尼日利亞菌素作用下，巨噬細(xì)胞caspase-1(圖2A)和GSDMD(圖2B)的活性形式即片段化條帶明顯增強(qiáng)，UTI的干預(yù)有效減弱了該作用?；叶确治霰砻?，UTI預(yù)處理降低了LPS/尼日利亞菌素刺激所致的caspase-1活化，且GSDMD片段化水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 UTI預(yù)處理對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-18 mRNA及蛋白表達(dá)的影響RT-qPCR結(jié)果顯示，LPS/尼日利亞菌素聯(lián)合刺激后，細(xì)胞中IL-1β及IL-18 mRNA水平上升，兩者在細(xì)胞上清中的釋放明顯增加。UTI預(yù)處理明顯降低了LPS/尼日利亞菌素作用下細(xì)胞上清中IL-1β(403.50±92.63pg/mlvs.253.50±62.93pg/ml，P=0.015)和IL-18的釋放水平(325.32±23.33pg/mlvs.216.02±38.18pg/ml，P=0.009，圖3)。

圖1 UTI對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細(xì)胞存活率(A)及LDH釋放率(B)的影響(n=3)Fig.1 Effects of ulinastatin on cell viability (A) and LDH release rate (B) of LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

圖2 UTI對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細(xì)胞caspase-1活化(A)與GSDMD片段化(B)的影響(n=3)Fig.2 Influence of ulinastatin on caspase-1 activity (A) and GSDMD gragmentation (B) in LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

2.4 UTI預(yù)處理對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細(xì)胞上清TNF-α和IL-6水平的影響 在LPS/尼日利亞菌素作用下，巨噬細(xì)胞釋放的重要炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6的水平明顯升高(P＜0.05)。在相同LPS/尼日利亞菌素條件刺激下，經(jīng)UTI預(yù)處理后，細(xì)胞上清TNF-α(311.30±33.02pg/mlvs.206.10±28.84pg/ml，P＜0.05)和IL-6(212.60±32.72pg/mlvs.143.77±6.36pg/ml，P＜0.05，圖4)水平明顯下降。

圖3 UTI對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)及蛋白釋放的影響(n=3)Fig.3 Effects of ulinastatin on mRNA expression and protein release of IL-1β and IL-18 in LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

圖4 UTI對(duì)LPS/尼日利亞菌素作用下巨噬細(xì)胞TNF-α(A)和IL-6(B)釋放的影響(n=3)Fig.4 Effects of ulinastatin on TNF-α (A) and IL-6 (B) release from LPS/Nigericin-treated macrophages (n=3)

3 討 論

膿毒癥的病理生理機(jī)制之一是過(guò)度的炎癥反應(yīng)，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，循環(huán)系統(tǒng)中的炎癥瀑布是導(dǎo)致多臟器功能衰竭的重要因素。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在感染狀態(tài)下發(fā)生的細(xì)胞焦亡與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在LPS/尼日利亞菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡中，LPS可與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)結(jié)合，促進(jìn)炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄增加；尼日利亞菌素則可通過(guò)活化炎性小體，募集caspase-1并使其發(fā)生自身剪切，進(jìn)而活化，活化的caspase-1可剪切IL-1β和IL-18的前體，使其成為活化形式[13]。同時(shí)，炎性小體的組成成分GSDMD發(fā)生剪切，參與形成細(xì)胞膜小孔，一方面，炎性介質(zhì)IL-1β、IL-18可通過(guò)小孔釋放至細(xì)胞外[14]；另一方面，小孔的形成導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變，進(jìn)而腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂?？梢?jiàn)，細(xì)胞焦亡在感染狀態(tài)下可通過(guò)誘導(dǎo)被感染細(xì)胞死亡，清除細(xì)胞內(nèi)的病原菌，限制其生長(zhǎng)。然而，大量的細(xì)胞焦亡可導(dǎo)致過(guò)度的炎癥反應(yīng)，IL-1β、IL-18的釋放又可激活其他免疫細(xì)胞向感染部位聚集，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，再次加劇炎癥因子釋放，導(dǎo)致發(fā)熱、低血壓等表現(xiàn)[15-16]。

巨噬細(xì)胞焦亡在感染狀態(tài)下放大炎癥反應(yīng)的特征提示其可能是導(dǎo)致膿毒癥過(guò)度炎癥反應(yīng)的原因。因此，本研究通過(guò)分離小鼠骨髓細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，以LPS/尼日利亞菌素聯(lián)合刺激構(gòu)建體外巨噬細(xì)胞焦亡模型，探討UTI在巨噬細(xì)胞焦亡中的作用。結(jié)果顯示，應(yīng)用UTI預(yù)處理后，巨噬細(xì)胞片段化caspase-1和GSDMD水平均明顯下降，同時(shí)IL-1β、IL-18 mRNA水平及上清中的分泌量均明顯降低，提示UTI可抑制巨噬細(xì)胞焦亡。

UTI最初是從尿液中分離出的一種尿胰蛋白酶抑制劑，可抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶等多種蛋白酶的活性[17]。UTI結(jié)構(gòu)中的糖肽結(jié)構(gòu)域具有穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用，是發(fā)揮蛋白酶釋放抑制作用的主要區(qū)域[18]。本研究顯示，UTI一方面可抑制焦亡關(guān)鍵蛋白caspase-1及GSDMD的片段化，阻抑焦亡信號(hào)通路的傳導(dǎo)；另一方面，細(xì)胞焦亡最終是由于細(xì)胞膜上形成GSDMD小孔，導(dǎo)致細(xì)胞破裂而死亡，UTI具有穩(wěn)定細(xì)胞膜作用的糖肽結(jié)構(gòu)域可能是其減緩巨噬細(xì)胞焦亡的另一機(jī)制。

細(xì)胞焦亡是一種極為劇烈的細(xì)胞炎癥反應(yīng)，也是一種細(xì)胞死亡方式。本研究顯示，UTI除可抑制巨噬細(xì)胞死亡外，還可抑制LPS/尼日利亞菌素刺激后巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和釋放水平。一方面，UTI可抑制LPS刺激后的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族磷酸化及NF-κB活化[19–21]，降低炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平；另一方面，目前認(rèn)為IL-1β/IL-18激活和分泌主要依賴于caspase-1，而UTI抑制caspase-1活化，可抑制IL-1β及IL-18的剪切成熟。同時(shí)，UTI可穩(wěn)定細(xì)胞膜，抑制GSDMD小孔形成，降低促炎癥因子的釋放。盡管IL-1β及IL-18不是細(xì)胞死亡程序中所必須的，但它們的產(chǎn)生有助于焦亡細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)與機(jī)體強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的發(fā)熱、低血壓相關(guān)[22]。本研究初步揭示了UTI降低炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，為其在膿毒癥治療中的應(yīng)用提供了依據(jù)。