劉 穎，廖聯(lián)瓊，胡凌云，吳春磊

胃癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，具有較高病死率[1]。由于胃癌的發(fā)生和發(fā)展屬于一個(gè)多階段、多因素及多基因的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，而目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。因此，積極探究胃癌發(fā)病機(jī)制，對(duì)其早期診斷方案的制定有一定參考意義[2]。胃癌相關(guān)基因213（GCRG213）和CDX2蛋白是與人類關(guān)系最為密切的抑癌基因，其基因結(jié)構(gòu)的變化可使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[3]。其中GCRG213是表達(dá)在胃黏膜組織中的具有典型特征的基因，相關(guān)研究提示，其在胃癌細(xì)胞胞漿中呈陽(yáng)性表達(dá)，而術(shù)后組織切片中的非癌變組織中（黏膜層的被覆上皮）呈陰性表達(dá)[4]；另有研究指出，CDX2蛋白在胃癌從腸上皮演變至癌瘤過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其是在腸型胃癌疾病進(jìn)展中作用明顯[5]。本研究旨在探究胃癌組織中GCRG213和CDX2蛋白表達(dá)水平的變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取2014年11月～2016年8月于四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院和南充市中心醫(yī)院收治的100例胃癌患者為研究對(duì)象，其中男、女各66、34例，年齡 30～65（49.12±10.21）歲，乳頭狀腺部、管狀腺癌、低分化腺癌各 35、20、45例。

1.2 標(biāo)本采集 本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均為手術(shù)切除或胃鏡活檢的胃癌及及癌旁正常胃組織標(biāo)本切片。

1.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)GCRG213及CDX2蛋白 取人胃正常組織黏膜泌酸（非泌酸）腺區(qū)組織、高度不典型增生伴癌變組織、胃中低分化腺癌組織切片各1張，置入高溫烤箱中，20 min后將切片取出、脫蠟，浸泡 2 次（95%乙醇中），5 min/次；80%乙醇中浸泡3 min，采用pH值為7.4的PBS沖洗液沖洗 3次，3 min/次，采用高壓熱修復(fù) 2 min；加50 μl 3%過(guò)氧化氫溶液到各切片中，室溫下孵育10 min，活化內(nèi)源性過(guò)氧化物；PBS沖洗 3次，3 min/次，及時(shí)去除PBS液；檢測(cè)GCRG213、CDX2的每張切片各加 50 μl的一抗（GCRG213，1∶800）或（CDX2，1∶200），4 ℃過(guò)夜；PBS 沖洗 3 次，5 min/次；PBS液去除后，每張切片加50 μl蛋白免疫組化顯色試劑，室溫下孵育30 min；PBS液沖洗3 min，反復(fù)沖洗3次，及時(shí)去除PBS液；每張切片滴加DAB顯色劑100 μl，顯色3～5 min。自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，藍(lán)化，行脫水、透明，中性樹(shù)脂封片并進(jìn)行鏡檢，采用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性表達(dá)切片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 切片病理觀察 在低倍鏡下，每一切片選組織結(jié)構(gòu)良好且背景清晰的陽(yáng)性細(xì)胞最密集5個(gè)區(qū)域，每區(qū)域隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞著色程度和構(gòu)成比。所有鏡檢和觀察分析均由病理科同一名專業(yè)醫(yī)師完成。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性著色程度評(píng)分，無(wú)色=0分，黃色=1分，棕黃色=2分，棕褐色=3分；陽(yáng)性細(xì)胞構(gòu)成比評(píng)分：＜5%=0分，6%～25%=1 分，26%～50%=2分，51%～75%=3分，＞75%=4分。上述兩者評(píng)分乘積為 0時(shí)，判定為陰性（-）；≥1分時(shí)，判定為陽(yáng)性（+）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用例和百分率表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GCRG213蛋白在胃癌組織及胃正常組織中的表達(dá) 在高度不典型增生伴癌變組織（圖1）和中低分化腺癌組織（圖2）中，胃癌細(xì)胞的胞漿中可見(jiàn)棕黃色顆粒，表明GCRG213蛋白為高表達(dá)。在人正常胃黏膜組織的非泌酸腺區(qū)無(wú)棕黃色顆粒（圖3），表明GCRG213蛋白陰性表達(dá)；而在人正常胃黏膜組織的泌酸區(qū)，可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)均勻淺黃色信號(hào)，表明GCRG213蛋白陽(yáng)性表達(dá)，以靠近黏膜下層的固有腺體最為明顯，而近胃腔側(cè)的固有腺體中信號(hào)逐漸減弱，直至黏膜覆上皮而呈陰性（圖4）。

2.2 CDX2蛋白在胃癌及癌旁正常胃組織中的表達(dá) CDX2蛋白在正常胃粘膜組織中的表達(dá)呈陰性（圖5），在不完全小腸型腸化生的細(xì)胞核呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖6、7），在異型增生組織的細(xì)胞核呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖 8）。

2.3 不同病理參數(shù)患者胃癌組織中GCRG213和CDX2蛋白的陽(yáng)性率比較 分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ的胃癌組織中GCRG213蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高分化、Ⅲ+Ⅳ期的明顯增高（P＜0.05），分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ、胃腸組織分型為腸型的胃癌組織中CDX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高分化、Ⅲ+Ⅳ期、彌漫型的明顯增高（P＜0.05），其他病理參數(shù)比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.4 胃癌組織中GCRG213和CDX2蛋白與病理因素的相關(guān)性分析 GCRG213蛋白陽(yáng)率與組織分化程度、臨床分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.423、-0.399，P＜0.05）；CDX2蛋白陽(yáng)性率與組織分化程度、臨床分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.353、-0.369，P＜0.05），與彌漫型胃癌檢出率呈正相關(guān)（r=0.326，P＜0.05）。

圖1 高度不典型增生伴癌變組織

圖2 中低分化腺癌組織

圖3 正常胃黏膜組織的非泌酸區(qū)

圖4 正常胃黏膜組織的泌酸區(qū)

圖5 正常胃黏膜組織

圖6 不完全小腸型腸化生的細(xì)胞核

圖7 不完全小腸型腸化生的細(xì)胞核

圖8 異型增生組織的細(xì)胞核

3 討論

雖然對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展的完整分子機(jī)制尚未完全闡明，但癌基因的顯性作用及抑癌基因的失活是惡性腫瘤發(fā)生的生理基礎(chǔ)的觀點(diǎn)已成為共識(shí)。GCRG213基因是核酸內(nèi)切酶的一種變異體，該基因的篩選早期多采取胃竇區(qū)組織[6]，本研究發(fā)現(xiàn)，其在高度不典型增生伴癌變組織及中低分化腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，在人胃正常黏膜非泌酸腺區(qū)呈陰性表達(dá)，而在人胃正常黏膜的泌酸腺區(qū)的固有腺體中呈一定程度的陽(yáng)性表達(dá)，這與以往研究證實(shí)的GCRG213蛋白在癌旁組織及癌組織的表達(dá)較正常組織明顯高的結(jié)論相符。本研究也發(fā)現(xiàn)，GCRG213蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與組織分化程度、臨床分期有明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.423、-0.399，P＜0.05），初步證實(shí)了GCRG213蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌病理過(guò)程緊密相關(guān)[7-8]。

表1 不同病理參數(shù)患者胃癌組織中GCRG213和CDX2蛋白的陽(yáng)性率比較

CDX2蛋白表達(dá)于正常腸黏膜上皮細(xì)胞，在維持腸黏膜的正常發(fā)育及分化中發(fā)揮重要作用，在腸癌中發(fā)揮抑癌細(xì)胞的作用，但在正常胃黏膜中無(wú)表達(dá)[9]。既往研究表明，CDX2在胃黏膜腸上皮化生以及隨后的胃癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[10]。早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，CDX2蛋白在胃黏膜的表達(dá)誘導(dǎo)了胃黏膜腸上皮化生的發(fā)生，長(zhǎng)期腸上皮化生促使了胃癌（有侵襲性的）的發(fā)生；本研究也證實(shí)CDX2蛋白在人胃癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，而在癌旁正常胃組織中呈陰性表達(dá)，CDX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與組織分化程度、 臨床分期也呈負(fù)相關(guān)（r=-0.353、-0.369，P＜0.05），與彌漫型胃癌檢出率呈明顯正相關(guān)，表明CDX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌病理過(guò)程緊密相關(guān)。

綜上所述，GCRG213和CDX2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)各具特點(diǎn)，聯(lián)合檢測(cè)GCRG213與CDX2蛋白表達(dá)水平，有助于胃癌分化程度、腫瘤分期的鑒別診斷。