趙 榮 敏

(石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081)

油菜是我國重要經(jīng)濟(jì)作物之一.菜籽油是人們生活主要植物食用油.菜籽餅粕是油菜籽榨油加工后的副產(chǎn)品，可以替代部分飼用蛋白或作為肥料使用.目前，國內(nèi)生產(chǎn)的菜籽餅粕中蛋白質(zhì)含量35%～40%，菜籽多糖含量2%左右，植酸2%～3%.由于品種不同，菜籽餅粕中糖的組成成分也不盡相同，但大體上有以下幾種:果糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇半乳糖苷、雙半乳糖甘油、棉子糖、水蘇糖，這些基本組成使得菜籽餅粕中的糖類具有重要的營養(yǎng)價值[1].因此對菜籽餅粕多糖(PRMs)免疫活性的研究有重要的意義.本文從菜籽餅粕中提取多糖，并研究其對小鼠免疫功能的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽餅粕(采用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院設(shè)計(jì)的菜籽冷榨設(shè)備壓榨出)、小白鼠(昆明種，雌雄各半，體重在18～22 g左右，安徽中醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心提供)、飼料(安徽中醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心提供)、二硝基亞砜(DMSO,碧云天生物技術(shù)公司)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、小牛血清(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(杭州四季青生物有限公司)、刀豆球蛋白(ConA，杭州四季青生物有限公司)、噻唑藍(lán)(MTT,Sigma公司)、環(huán)磷酰胺(CTX,Sigma公司)、綿陽紅細(xì)胞(SRBC，安徽醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心、雞血(市售健康公雞)、氫氧化鈉、Hanks液、三氯乙酸、無水乙醇、無水乙醚、丙酮.

1.2 儀器與設(shè)備

721分光光度計(jì)、TDL-50B高速離心機(jī)、BIROD Model 680 CO2培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、無菌超凈工作臺、MCO-17AIC酶標(biāo)儀、干燥機(jī)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、不銹鋼鑷子、不銹鋼剪刀、移液槍及槍頭、大孔吸附樹脂、透析袋、三角瓶、注射器、電子天平、200目紗布及玻璃器皿等.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PRMs提取及純化

在本實(shí)驗(yàn)中用氫氧化鈉做提取劑.精確稱取一定量脫脂后的菜籽放入三角燒瓶中，按1∶10的液料比，放入水浴鍋熱水(溫度70 ℃)浸提2 h，殘?jiān)俅谓? h后抽濾，并合并濾液.用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃下將濾液濃縮至一定體積，加入10%的三氯乙酸溶液靜置過夜以除去蛋白質(zhì)，離心取上清液.然后通過特1號大孔吸附樹脂進(jìn)行初步純化，除去游離的黃酮、脂類、蛋白質(zhì)以及色素等物質(zhì)，再將處理過的多糖溶液裝入3500截留分子量的透析袋中，經(jīng)自來水流水透析24 h，再經(jīng)蒸餾水透析24 h.然后用無水乙醇、無水乙醚和丙酮脫色兩次，最后將純化的溶液在冷凍干燥機(jī)中干燥或粉末狀，得到菜籽餅粕多糖，經(jīng)檢測，純度大于等于95%.

1.3.2 動物分組和給藥方法

將50只昆明小鼠隨機(jī)平均分為5組，依次為空白對照組、CTX對照組、多糖高劑量組(300 mg/L)、多糖中劑量組(200 mg/L)、多糖低劑量組(100 mg/L).實(shí)驗(yàn)前將小鼠預(yù)飼養(yǎng)一周，溫度23 ℃，相對濕度60%，飲水為自來水，自由飲水，喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)鼠專用飼料.對小鼠進(jìn)行多糖灌胃為期30 d.每日一次，分別按體重計(jì)算，高劑量組給藥量為0.016 mL/g，中劑量組給藥量為0.012 mL/g，低劑量組給藥量為0.008 mL/g，對照組灌生理鹽水.CTX對照組第5 d起開始注射CTX，采用腹腔注射，注射量為0.024 mg/g小鼠體重，CTX濃度為3 mg/mL.

1.3.3 對免疫器官質(zhì)量影響

末次給藥后的次日，小鼠經(jīng)眼眶放血處死，用電子天平精確稱取小鼠的體質(zhì)量、胸腺質(zhì)量、脾臟質(zhì)量.按以下公式計(jì)算小鼠的脾指數(shù)及胸腺指數(shù)[2].

脾指數(shù)=脾重(mg)/體重(g)，

胸腺指數(shù)=胸腺重(mg)/體重(g).

1.3.4 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響

無菌條件下向小鼠腹腔注入Hanks液，針尖朝上，避開腸和脂肪，回抽取腹腔液，不同方向沖洗數(shù)次，吸出腹腔液.細(xì)胞懸液離心速度2000 r/min，離心時間5 min，收集細(xì)胞，用Hanks液沖洗一次，用含5%的小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸起腹腔巨噬細(xì)胞，濃度控制在2×107個/mL，細(xì)胞懸液置入培養(yǎng)瓶，37 ℃培養(yǎng)2 h，吸取上清液，用預(yù)熱培養(yǎng)基清洗2次，留下貼壁細(xì)胞[3]，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi).設(shè)對照組：100 μL細(xì)胞懸液+100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液+100 mL PBS溶液；陽性對照組：100 μL細(xì)胞懸液+100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液+50 mL PBS液+50 μL ConA；給藥組：100 μL細(xì)胞懸液+100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液+100 mL多糖溶液(濃度分別為100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L).置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入15 μL MTT溶液(濃度為5 mg/mL),再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，棄上清，然后加入30%的DMSO 100 μL，充分振蕩后靜置20 min，用酶標(biāo)儀于570 nm處測光密度,分析比較各試驗(yàn)組與對照組的差異,加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表腹腔巨噬細(xì)胞的增殖能力[4].

1.3.5 對小鼠溶血素抗體生成的影響

實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組，多糖低劑量組，多糖中劑量組,多糖高劑量組,末次給藥前4 d，每鼠腹腔注射2%SRBC、生理鹽水0.01 mL/g小鼠體重進(jìn)行免疫，并繼續(xù)給藥.于免疫4 d后每鼠眼眶取血，分離血清.取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清1 mL，加5%SRBC 0.5 mL，10%補(bǔ)體(新鮮小鼠混合血清經(jīng)SRBC于4 ℃吸收30 min)0.5 mL混合，在37 ℃恒溫箱中保溫30 min后，0 ℃冰箱中終止反應(yīng).離心，取上清液于540 nm處測定光密度值.另設(shè)不加血清的空白管，取其上清液作空白[5].

2 結(jié)論與分析

2.1 PRMs對免疫器官的影響

PRMs對脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響見表1.

表1 PRMs 對脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

脾腺和胸腺是體內(nèi)重要的免疫器官，在淋巴細(xì)胞的成熟過程中起著重要的作用，脾指數(shù)、胸腺指數(shù)是評價機(jī)體免疫機(jī)能狀況的重要指標(biāo)之一.從表1可以看出，與空白對照組相比，PRMs使小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)都有所增加，但是不同濃度的 PRMs對其影響程度不同，說明PRMs濃度在一定程度上影響小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù).與CTX對照組相比效果較明顯，注射CTX后的小鼠的脾臟、胸腺有所萎縮,其原因可能是注射CTX會造成免疫器官的永久性萎縮，并且肝臟的顏色與未注射CTX的小鼠的肝臟顏色相比很淺.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該劑量范圍內(nèi)，PRMs可以使小鼠的脾臟和胸腺質(zhì)量增加，促進(jìn)其產(chǎn)生免疫細(xì)胞，提高免疫功能.

2.2 PRMs對腹腔巨噬細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

PRMs對腹腔巨噬細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響見表2.

表2 PRMs 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響

從表2數(shù)據(jù)可知，PRMs能明顯促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖，與對照組相比效果明顯.不同濃度PRMs對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖情況的影響不同.100 mg/L濃度的PRMs增殖作用最差，但與ConA誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖情況比較有所增加.其中300 mg/L濃度的PRMs增殖作用最好,200 mg/L 濃度的PRMs增殖活力比300 mg/L濃度的差，但比100 mg/L的濃度的高.所有給藥組與對照組相比，增殖作用都明顯提高.因此，在該劑量范圍內(nèi)PRMs有促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增值作用，且效果比ConA明顯.

2.3 PRMs對溶血素抗體生成的影響

PRMs對溶血素抗體生成的影響見表3.

表3 PRMs對溶血素抗體生成的影響

從表3數(shù)據(jù)可知，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組都不同程度地提高了小鼠溶血素抗體的生成量,可以看出PRMs有促進(jìn)小鼠溶血素抗體生成的作用.

3 結(jié)語

研究表明，菜籽餅粕多糖可以提高小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，能明顯促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖和溶血素的生成，具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能.