傅玲琳，謝夢(mèng)華，王 翀，王海燕，王彥波,

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018）

食物過(guò)敏是對(duì)無(wú)害食物蛋白質(zhì)產(chǎn)生的不良反應(yīng)，分為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E和非IgE介導(dǎo)、IgE和非IgE混合介導(dǎo)，其中IgE介導(dǎo)最為常見(jiàn)。近些年來(lái)其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)急劇上升，約8%的兒童及4%的成人對(duì)某種或多種食物有過(guò)敏現(xiàn)象，食物過(guò)敏嚴(yán)重影響了人們的生活[1]。目前除了避免接觸過(guò)敏原及服用一些可能會(huì)產(chǎn)生副作用的藥物外，對(duì)食物過(guò)敏還沒(méi)有有效的預(yù)防及治療手段[1]。我國(guó)東部地區(qū)水產(chǎn)豐富，消費(fèi)群體龐大。因此，作為全球八大主要食物過(guò)敏原之一的甲殼類水產(chǎn)品在我國(guó)引起食物過(guò)敏的發(fā)病率居高不下。研究表明，甲殼類水產(chǎn)品中引起過(guò)敏現(xiàn)象的主要過(guò)敏原為原肌球蛋白（tropomyosin，TM），且氨基酸序列檢測(cè)結(jié)果表明，多種甲殼類水產(chǎn)中的TM具有高達(dá)95%～100%的同源性[2-3]。但目前對(duì)于甲殼類水產(chǎn)品過(guò)敏原在分子及免疫學(xué)水平的研究還很匱乏。

食物過(guò)敏預(yù)防及治療的研究大多會(huì)借助動(dòng)物構(gòu)建食物過(guò)敏原致敏模型，基于此模型可以評(píng)估食物過(guò)敏原致敏性，研究過(guò)敏相關(guān)免疫反應(yīng)及機(jī)理，研發(fā)預(yù)防及治療食物過(guò)敏的藥物及治療手段[4]，其中小鼠是最常采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。小鼠模型根據(jù)給藥途徑不同分為兩大類，即口服致敏和局部或表皮致敏，局部致敏常采用腹腔注射（intraperitoneal，IP）[5]。過(guò)敏原的口服給藥符合實(shí)際生活中食物蛋白經(jīng)口攝入的情況，但易誘導(dǎo)產(chǎn)生口服耐受，若僅給藥過(guò)敏原，則需要大量的過(guò)敏原才能引起免疫反應(yīng)，因此必須借助黏膜佐劑以克服口服免疫耐受，降低過(guò)敏原劑量，使小鼠更容易致敏，其中最常用也是公認(rèn)的最強(qiáng)佐劑是霍亂毒素（cholera toxin，CT）[3,5]。CT是一種AB5型蛋白毒素，由1 個(gè)帶有毒性的A亞基（CTA）和5 個(gè)無(wú)毒的B亞基（CTB）組成，可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5顯著升高，而IL-2與干擾素-γ（interferon gamma，IFN-γ）水平無(wú)明顯變化，而且還可選擇性誘導(dǎo)以輔助性T細(xì)胞（helper T cells，Th）2為主的免疫反應(yīng)[6]。過(guò)敏原腹腔注射作用部位接近黏膜，更易引起黏膜免疫反應(yīng)，致敏效果好，但食物蛋白不經(jīng)胃部消化，不能很好地反映其實(shí)際進(jìn)入機(jī)體的情況。目前，這兩種給藥方法均被廣大研究者采用，如利用腹腔注射模型或口服灌胃（intragastric，IG）模型評(píng)估膳食纖維、中草藥、益生菌、海洋藻類、T細(xì)胞多肽等物質(zhì)緩解食物過(guò)敏的效果、探究其生理學(xué)及免疫學(xué)水平機(jī)理[7-11]。Chen Chen等[12]為構(gòu)建一個(gè)能全面評(píng)估食物過(guò)敏的BALB/c小鼠模型，采用腹腔注射，分別用花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）和馬鈴薯酸性磷酸酶（potato acid phosphatase，PAP）3 種蛋白致敏小鼠，再采用口服灌胃或腹腔注射相應(yīng)蛋白進(jìn)行激發(fā)，通過(guò)測(cè)定血清特異性IgE（specific IgE，sIgE）、IgG1、組胺、臨床癥狀及肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等指標(biāo)水平，發(fā)現(xiàn)3 種蛋白的致敏性強(qiáng)弱為PNA＞β-LG＞PAP，且腹腔注射激發(fā)更易誘發(fā)系統(tǒng)性食物過(guò)敏。然而，目前關(guān)于甲殼類水產(chǎn)品的口服致敏模型研究有限，其致敏的具體機(jī)制也尚鮮有闡明。

本研究以甲殼類水產(chǎn)品主要過(guò)敏原TM為研究對(duì)象，對(duì)比口服灌胃與腹腔注射兩種給藥方式對(duì)BALB/c小鼠的致敏效果，尋求TM致敏動(dòng)物模型的最佳給藥途徑，以便建立有效的TM致敏動(dòng)物模型，并初步探究?jī)煞N給藥方式產(chǎn)生不同致敏效果的分子及免疫學(xué)機(jī)理，既為其他食物過(guò)敏原的動(dòng)物模型構(gòu)建提供一定的理論依據(jù)，也便為后期研究食物過(guò)敏預(yù)防及治療提供一定的模型及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦購(gòu)自杭州蕭山養(yǎng)殖場(chǎng)；SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性，6 周齡，體質(zhì)量為（16±2） g，共80 只，隨機(jī)分組，每組8 只。

喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；小鼠組胺酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 杭州百細(xì)生物有限公司；大鼠抗小鼠IgE單克隆抗體（rat monoclonal 23G3 anti-mouse IgE epsilon chain）、大鼠抗小鼠IgG2a單克隆抗體（rat monoclonal SB84a anti-mouse IgG2a heavy chain） 美國(guó)Abcam公司；小鼠細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IFN-γ ELISA試劑盒，Anti-mouse CD4 FITC、Anti-mouse CD25 PE、Anti-mouse CD127 APC單抗 美國(guó)eBioscience公司；RNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒 南京諾唯贊生物公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）相關(guān)用品 生工生物工程（上海）股份有限公司；其余常規(guī)化學(xué)試劑 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini protein III垂直板電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（配有Alphaview SA電泳圖像分析軟件） 美國(guó)Proteinsimple公司；VersaMax型酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；LightCycler Nano qPCR儀 瑞士Roche公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 TM的提取

參考傅玲琳等[13]的方法提取對(duì)蝦肉中的TM。將對(duì)蝦除去頭、尾、蝦線和外殼，蝦肉浸泡于預(yù)冷的緩沖液A（50 mmol/L KCl、2 mmol/L NaHCO3）中，均質(zhì)30 min后置于冰上浸提20 min并不斷攪拌。4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄去上清液，將沉淀重懸于緩沖液A中，再次浸提后離心，重復(fù)浸提、離心5 次。沉淀浸泡于預(yù)冷的丙酮中，不斷攪拌后經(jīng)紗布過(guò)濾，用丙酮反復(fù)沖洗，直至沉淀完全變?yōu)榘咨?，將制成的丙酮粉置于通風(fēng)櫥中，過(guò)夜風(fēng)干。將風(fēng)干的丙酮粉浸泡于緩沖液B（0.02 mol/L Tris-HCl、1 mol/L KCl、0.1 mmol/L二硫蘇糖醇，pH 7.4）中抽提72 h，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)移至沸水浴中加熱煮沸10 min，再經(jīng)8 000 r/min離心15 min，取出上清液，加入30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的硫酸銨，置于4 ℃孵育1 h，拿出后4 ℃、8 000 r/min離心15 min，將沉淀復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.2～7.4）中。用BCA蛋白質(zhì)量濃度試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.2 SDS-PAGE分析

配制12%的分離膠與5%的濃縮膠，厚度為1.0 mm。取少量溶于PBS的TM，用PBS稀釋至1～3 ng/μL，與4×蛋白質(zhì)SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱5 min后取7 μL上樣。濃縮膠80 V電泳10 min后，分離膠120 V電泳60 min。

1.3.3 BALB/c小鼠致敏模型

口服灌胃致敏模型[14-16]：共5 組，分為正常對(duì)照組（PBS1）、霍亂毒素對(duì)照組（CT）、低劑量組（IG-L）、中劑量組（IG-M）、高劑量組（IG-H）。小鼠普通飲食飼養(yǎng)1 周后，實(shí)驗(yàn)組每只灌胃與10 μg CT充分混勻的相應(yīng)劑量的TM（100、300、600 μg）進(jìn)行致敏，PBS1組灌胃等體積PBS，CT組灌胃等體積含10 μg CT的PBS，每周2 次，連續(xù)4 周。之后灌胃對(duì)應(yīng)致敏劑量6 倍的TM進(jìn)行激發(fā)，每周1 次，連續(xù)2 周。在致敏前和致敏后、第一次激發(fā)以及第二次激發(fā)后1 d取血，具體方案見(jiàn)圖1a。

腹腔注射致敏模型[9,11]：共5 組，分為正常對(duì)照組（PBS2）、弗氏佐劑對(duì)照組（F）、低劑量組（IP-L）、中劑量組（IP-M）、高劑量組（IP-H）。小鼠普通飲食飼養(yǎng)1 周后，實(shí)驗(yàn)組每只腹腔注射與弗氏佐劑（第一次致敏時(shí)使用弗氏完全佐劑，之后均為弗氏不完全佐劑）充分乳化的相應(yīng)劑量的TM（100、300、600 μg）進(jìn)行致敏，PBS2組注射等體積PBS，F(xiàn)組注射等體積的弗氏佐劑與PBS混合液，每周1 次，連續(xù)4 周；之后灌胃對(duì)應(yīng)致敏劑量3 倍的TM進(jìn)行激發(fā)，每周1 次，連續(xù)2 周。在致敏前、致敏后、第一次激發(fā)以及第二次激發(fā)的后1 d進(jìn)行眼眶靜脈取血，具體方案見(jiàn)圖1b。

圖1 BALB/c小鼠TM免疫方案Fig. 1 Experimental design of in vivo sensitization with shrimp TM in BALB/c mice

1.3.4 小鼠臨床過(guò)敏癥狀評(píng)分

在第二次激發(fā)后的30 min～2 h內(nèi)觀察小鼠的癥狀，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，本實(shí)驗(yàn)中臨床過(guò)敏癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 小鼠臨床過(guò)敏癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7,9]Table1 Scoring criteria for clinical anaphylactic symptoms in mice[7,9]

1.3.5 血清中TM特異性抗體IgE、IgG2a的測(cè)定

小鼠血清中TM特異性抗體IgE、IgG2a抗體反應(yīng)均采用雙抗體夾心間接ELISA法檢測(cè)。EIA/RIA 96 孔板包被10 μg/mL純化的TM，4 ℃孵育過(guò)夜；用PBS＋0.05%吐溫20溶液洗滌3 次后，用5%牛血清白蛋白封閉，37 ℃孵育1 h；洗滌3 次后加入小鼠血清樣品（稀釋5 倍用于IgE抗體，稀釋20 倍用于IgG2a抗體），37 ℃孵育2 h；洗滌5 次后加入辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（HRP-大鼠抗小鼠IgE單克隆抗體或HRP-大鼠抗小鼠IgG2a單克隆抗體），37 ℃孵育1 h；洗滌5 次后加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺底物，37 ℃避光孵育20 min后加入終止液，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.3.6 血清中組胺質(zhì)量濃度的測(cè)定

血清中的組胺采用小鼠組胺ELISA試劑盒測(cè)定。在微孔酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或小鼠血清（稀釋5 倍），再加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，用封口膜封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育1 h；洗滌5 次后，加入底物A、B，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到每組樣品的組胺質(zhì)量濃度。

1.3.7 脾臟共培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的測(cè)定

在第46天，將處死的小鼠浸泡于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中，于超凈工作臺(tái)中解剖取出小鼠脾臟，加入少量PBS，用無(wú)菌注射器研磨過(guò)200 目篩，將濾液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌15 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，加入紅細(xì)胞裂解液，室溫反應(yīng)5 min后4 ℃、4 000 r/min離心3 min，再用PBS洗滌2 次后制成單細(xì)胞懸液，最后用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為106～107個(gè)/mL。取1 mL加入24 孔板中，加入已經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜的TM（終質(zhì)量濃度100 μg/mL），于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。再經(jīng)4 000 r/min離心5 min，取上清液。IL-4、IL-5、IL-13脾臟共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的檢測(cè)均采用ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.8 結(jié)腸中Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子IL-17A、IL-23 mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

無(wú)菌條件下解剖小鼠，剪下結(jié)腸部位，放入凍存管，迅速置于液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出樣品，立即置于液氮中研磨，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，用NanoDrop 2 000測(cè)定RNA質(zhì)量濃度及純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑盒進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄和IL-17A、IL-23 mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。各基因引物設(shè)計(jì)如下：IL-17A上游引物：AGGGAGAGCTTCATCTGTGG，下游引物：AGATTCATGGACCCCAACAG；IL-23上游引物：TGCTGGATTGCAGAGCAGTAA，下游引物：GCATGCAGAGATTCCGAGAGA；β-actin上游引物：CGCAAAGACCTGTATGCCAAT，下游引物：GGGCTGTGATCTCCTTCTGC。

1.3.9 流式細(xì)胞儀測(cè)定脾臟中Treg細(xì)胞比例

小鼠脾臟組織的單細(xì)胞懸液的制備方法同1.3.7節(jié)，用無(wú)菌PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為107～108個(gè)/mL。各組分別取100 μL單細(xì)胞懸液于流式管中，每管分別按照流式抗體說(shuō)明書(shū)加入Anti-mouse CD4 FITC、Anti-mouse CD25 PE和Anti-mouse CD127 APC，室溫下避光孵育30 min。1 000×g離心5 min后棄上清液，以100 μL無(wú)菌PBS洗滌2 次后，用PBS重懸細(xì)胞并混勻。同時(shí)設(shè)定空白組（只加細(xì)胞細(xì)胞懸液）以及陰性對(duì)照組（加入細(xì)胞懸液及各抗體單染組）用于流式細(xì)胞儀補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)?；靹驑悠肥褂昧魇郊?xì)胞儀檢測(cè)，并設(shè)門測(cè)定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）（CD4＋CD25＋CD127Low）比例。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)得到的所有數(shù)據(jù)使用軟件GraphPad Prism 7.00進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析和單因素方差分析，結(jié)果以的的形式呈現(xiàn)，以P＜0.05表示差異顯著，以NS表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 TM的SDS-PAGE分析結(jié)果

圖2 純化TM的SDA-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified TM

不同批次的南美白對(duì)蝦肉通過(guò)硫酸銨沉淀、PBS復(fù)溶后的SDS-PAGE分析見(jiàn)圖2。其中灰度最深的條帶在36.1 kDa，與理論計(jì)算值相同[17]，因此可以確定所提蛋白為TM，利用AlphaView SA 3.4.0電泳圖像分析軟件分析可知，TM純度大于95%，其他分子質(zhì)量位置雖有少量雜蛋白，但含量極低，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

2.2 食物過(guò)敏評(píng)價(jià)指標(biāo)的結(jié)果分析

過(guò)敏原穿透皮膚或者黏膜屏障后，由樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）收集并遞呈給淋巴結(jié)中的初始輔助性T細(xì)胞Th0，激活的Th0在IL-4的存在下分化為Th2，行使T細(xì)胞功能，并促使B細(xì)胞表面的B細(xì)胞受體結(jié)合過(guò)敏原，從而激活B細(xì)胞。激活的B細(xì)胞和Th2效應(yīng)細(xì)胞通過(guò)表達(dá)的組織特異性歸巢受體，由胸導(dǎo)管和血液循環(huán)再回到過(guò)敏原進(jìn)入的組織中，此時(shí)，Th2會(huì)產(chǎn)生豐富的IL-4、IL-5和IL-13，使活化的B細(xì)胞發(fā)生IgE類型轉(zhuǎn)換，從而產(chǎn)生抗原sIgE。這些抗體一部分與抗原直接結(jié)合，一部分能與抗原穿透部位的肥大細(xì)胞所表達(dá)的高親和力IgE-Fc段受體I（FcεRI）結(jié)合，其余的抗體則通過(guò)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入人體循環(huán)，與血液中的嗜堿性粒細(xì)胞和遠(yuǎn)隔組織中的肥大細(xì)胞相結(jié)合，使機(jī)體致敏。當(dāng)致敏機(jī)體再次次攝入過(guò)敏原后，抗原會(huì)迅速與致敏肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的sIgE結(jié)合，使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、5-羥色胺、趨化因子等，而嗜堿性粒細(xì)胞分泌大量IL-4、IL-13等細(xì)胞因子，從而產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)組織特異性癥狀[18]。

2.2.1 食物過(guò)敏癥狀評(píng)分結(jié)果

致敏機(jī)體再次攝入過(guò)敏原后，會(huì)快速引發(fā)身體多個(gè)部位不同癥狀反應(yīng)，如皮膚瘙癢、紅腫、蕁麻疹、哮喘、咳嗽、惡心、嘔吐、腹瀉等[5]。因此，臨床過(guò)敏癥狀評(píng)分是評(píng)價(jià)食物過(guò)敏是否產(chǎn)生以及嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。腹腔注射模型組小鼠臨床過(guò)敏癥狀評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖3，而口服灌胃模型組小鼠基本未有明顯癥狀，因此沒(méi)有顯示數(shù)據(jù)。腹腔注射模型組中，IP-L組只有少數(shù)小鼠產(chǎn)生輕微的過(guò)敏癥狀，而隨著過(guò)敏原劑量的增加，小鼠的過(guò)敏癥狀逐漸增強(qiáng)。IP-H組中小鼠的過(guò)敏癥狀評(píng)分已出現(xiàn)4 分及5 分，即肌肉抽搐和死亡，表明腹腔注射過(guò)敏原劑量已接近小鼠最大耐受量，致敏效果顯著。

圖3 腹腔注射模型組小鼠第二次激發(fā)后過(guò)敏癥狀評(píng)分Fig. 3 Anaphylaxis scores of intraperitoneal sensitization model after the second challenge

2.2.2 不同致敏方式導(dǎo)致小鼠血清中TM特異性抗體IgE含量變化分析

圖4 兩類致敏模型小鼠血清中TM-sIgE含量變化Fig. 4 TM-sIgE levels in serum samples of two BALB/c mouse models

血清中sIgE的產(chǎn)生是評(píng)估食物過(guò)敏的重要指標(biāo)，且大量研究表明食物過(guò)敏的嚴(yán)重程度與機(jī)體內(nèi)特異性抗體水平密切相關(guān)[11-12,15,19]。在I型超敏反應(yīng)動(dòng)物模型中，攝入高濃度過(guò)敏原可能會(huì)導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生免疫耐受，從而降低小鼠的致敏性[1,4,20-21]，如胡德建等[20]通過(guò)對(duì)不同劑量致敏原對(duì)小鼠過(guò)敏性哮喘模型血清特異性抗體IgE、IgG2a和IL4、IL-5、IL-12、IFN-γ等炎性細(xì)胞因子的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同劑量的卵清蛋白（ovalbumin，OVA）可能影響小鼠過(guò)敏性哮喘模型所產(chǎn)生的細(xì)胞因子類型，低劑量OVA造模的效果最為顯著，高劑量OVA可能導(dǎo)致小鼠發(fā)生免疫耐受。根據(jù)圖4a可知，口服灌胃模型組TM-sIgE的OD490nm變化范圍大多都在0.2以內(nèi)，差別很小，只有IG-M組在第一次激發(fā)后IgE含量急劇上升，OD490nm達(dá)到0.5左右。但所有組別基本變化趨勢(shì)相同，在第一激發(fā)時(shí)，IgE含量均有所上升，但在第二次激發(fā)后，IgE含量均下降。在第二次激發(fā)后，與CT組相比，僅IG-M組差異顯著，其他兩組均無(wú)顯著性差異。根據(jù)文獻(xiàn)[20]報(bào)道，第二次激發(fā)后IgE含量不升反降的原因可能是：在39 d第一次激發(fā)時(shí)過(guò)敏原劑量為致敏時(shí)的6 倍，過(guò)敏原劑量的突然增大使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生耐受性，因此在第二次激發(fā)后sIgE的含量發(fā)生下降，此結(jié)論在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步研究確認(rèn)。而腹腔注射模型組小鼠在致敏結(jié)束后的IgE含量就已明顯高于口服灌胃模型組，且在激發(fā)后IgE含量逐漸上升。IP-H組在第二次激發(fā)時(shí)IgE的OD490nm超過(guò)0.6，IP-L和IP-M組的OD490nm也超過(guò)0.3，且與F組相比，IP-L、IP-M、IP-H 3 個(gè)劑量組均有顯著性差異，尤其是IP-H致敏效果最顯著。

2.2.3 不同致敏方式導(dǎo)致小鼠血清TM特異性抗體IgG2a含量變化分析

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清中抗體Ig的70%～75%。當(dāng)正常機(jī)體接觸或攝入過(guò)敏原，也會(huì)觸發(fā)一些免疫反應(yīng)，但產(chǎn)生的是無(wú)害IgG，而非IgE。研究表明，在多個(gè)利用小鼠模型研究抗過(guò)敏物質(zhì)及其機(jī)理的實(shí)驗(yàn)中，小鼠體內(nèi)的過(guò)敏原特異性免疫應(yīng)答會(huì)偏向Th1誘導(dǎo)的同型IgG2a轉(zhuǎn)換，而sIgE水平顯著下降[11,15]。Rupa等[11]將T細(xì)胞表位肽應(yīng)用于雞蛋過(guò)敏原卵類黏蛋白建立的BALB/c小鼠的口服免疫治療中，發(fā)現(xiàn)sIgE含量顯著下降，而特異性IgG2a（specific IgG2a，sIgG2a）含量顯著提高。本研究中兩種致敏模型小鼠血清中TM-sIgG2a含量如圖5所示。

圖5 兩類致敏模型小鼠血清中TM-sIgG2a含量變化Fig. 5 TM-sIgG2a levels in serum samples of two BALB/c mouse models

腹腔注射模型組中，TM-sIgG2a含量雖有輕微上升趨勢(shì)，且第二次激發(fā)時(shí)IP-H組與F組相比有顯著性差異，但口服灌胃模型組中IgG2a變化更為顯著，第二次激發(fā)后，口服灌胃IG-M組sIgG2a的OD490nm高達(dá)1.8，而腹腔注射的IP-H組的OD490nm只達(dá)到0.22。因此，口服灌胃模型組中sIgE含量較少，可能是因?yàn)闄C(jī)體自身免疫調(diào)節(jié)使免疫應(yīng)答趨向于Th1型，從而產(chǎn)生大量IgG2a，降低了致敏效果。

2.2.4 血清中組胺質(zhì)量濃度變化分析

在食物過(guò)敏反應(yīng)的效應(yīng)期，由肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放的組胺會(huì)與支持血管的平滑肌細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，使血管舒張、通透性增加，并且能誘導(dǎo)分泌細(xì)支氣管黏液，導(dǎo)致哮喘。除此之外，組胺還能作用于感覺(jué)神經(jīng)末梢，誘發(fā)濕疹部位瘙癢和花粉熱打噴嚏等癥狀[18]。因此，組胺質(zhì)量濃度也是評(píng)估食物過(guò)敏嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。

圖6 兩類致敏模型小鼠第二次激發(fā)后血清中組胺質(zhì)量濃度Fig. 6 Histamine levels in serum samples of two BALB/c mouse models after the second challenge

如圖6所示，在第二次激發(fā)后，口服灌胃模型組中IG-L組和IG-H組小鼠血清中組胺質(zhì)量濃度與CT組相比均無(wú)顯著性差異，僅IG-M組差異顯著；而腹腔注射模型組中IP-L、IP-M、IP-H組與F組相比均有顯著性差異，特別是IP-H組，組胺質(zhì)量濃度達(dá)到37 ng/mL，接近F組的2 倍。

2.2.5 小鼠脾臟細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IFN-γ的質(zhì)量濃度分析

由于Th0所處微環(huán)境中各種細(xì)胞因子及其他因子的存在，Th0主要分化為兩類不同的效應(yīng)細(xì)胞：Th1和Th2。目前認(rèn)為，Th1/Th2平衡紊亂、Th0向Th2分化、IgE含量增加是I型超敏反應(yīng)發(fā)作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[20,22]。Th2分泌IL-4、IL-5等多種細(xì)胞因子，而IL-4可誘導(dǎo)B細(xì)胞的Ig類別轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致IgE含量增加；IL-5具有趨化嗜酸性粒細(xì)胞聚集的作用，而嗜酸性粒細(xì)胞是參與炎癥浸潤(rùn)的主要效應(yīng)細(xì)胞，可加速相關(guān)組織結(jié)構(gòu)的破壞，這些炎癥細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子共同引發(fā)或促進(jìn)I型超敏反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。Th1及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞則可分泌IFN-γ、IL-10等細(xì)胞因子，抑制Th2型細(xì)胞因子的促炎作用及致敏原引發(fā)的過(guò)敏作用[20,23-24]。Th1和Th2這兩類效應(yīng)細(xì)胞通過(guò)各類細(xì)胞因子相互交叉調(diào)節(jié)彼此的分化和活性，有相互拮抗的作用。根據(jù)上述指標(biāo)，兩類模型中各自致敏效果最好的一組的Th1及Th2型細(xì)胞因子質(zhì)量濃度見(jiàn)圖7、8。

圖7 兩類致敏模型小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Th1型細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度Fig. 7 Th1 type cytokine concentrations in spleen cell culture supernatants from two BALB/c mouse models

圖8 兩類致敏模型小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Th2型細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度Fig. 8 Th2 type cytokine concentrations in spleen cell culture supernatants from two BALB/c mouse models

根據(jù)圖7、8可知，與CT組相比，IG-M組的IL-5、IL-13質(zhì)量濃度有所增加，IL-4質(zhì)量濃度無(wú)顯著性差異；而IP-H組與F組相比IL-4、IL-5、IL-13質(zhì)量濃度均顯著升高；IG-M組IFN-γ質(zhì)量濃度顯著升高，IL-10質(zhì)量濃度無(wú)顯著性差異，但與腹腔注射模型組相比質(zhì)量濃度顯著上升。IL-10并不是由Th1特定產(chǎn)生，幾乎所有的淋巴細(xì)胞都能合成，因此可能是CT使某些其他淋巴細(xì)胞分泌IL-10使之質(zhì)量濃度增加[24]。IG-M組的IL-5、IL-10及IFN-γ質(zhì)量濃度均高于IP-H組，而IL-4、IL-13則低于IP-H組。分析可得：口服灌胃組Th2型細(xì)胞因子質(zhì)量濃度大多低于腹腔注射組，而Th1型細(xì)胞因子則高于腹腔注射組，口服灌胃致敏效果不佳可能是由于機(jī)體產(chǎn)生耐受，影響Th1/Th2平衡，使得Th1細(xì)胞因子分泌增多，從而抑制了Th2型效應(yīng)細(xì)胞的分化與活性，降低了Th2細(xì)胞因子的分泌[22,25]。

2.2.6 小鼠結(jié)腸中Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子IL-17A、IL-23 mRNA相對(duì)表達(dá)量分析

圖9 兩類致敏模型小鼠結(jié)腸中Th17轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig. 9 Relative expression of Th17 type transcription factor in colon of two BALB/c mouse models

Th17是一類分化及細(xì)胞因子分泌都與Th1和Th2不同的促炎癥效應(yīng)細(xì)胞，最早在小鼠的自身免疫病研究中被發(fā)現(xiàn)。Th0在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）和IL-6存在下會(huì)分化為Th17，然后依靠IL-23維持生存和增殖，并分泌IL-17、IL-6，其中分泌IL-17是這類細(xì)胞獨(dú)特性質(zhì)[26]。研究證明，Th17與食物過(guò)敏的發(fā)生也存在相關(guān)性，當(dāng)食物過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生時(shí)，機(jī)體會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th17型免疫應(yīng)答并釋放大量IL-17、IL-6和IL-23等炎性細(xì)胞因子[27-29]。由圖9可知，分別與佐劑組相比：IG-M組的IL-17A mRNA相對(duì)表達(dá)量未有顯著變化，而IP-H組則顯著增加，且IG-M組與IP-H組相比也有顯著性差異；IG-M組與IP-H組的IL-23 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，且IG-M組與IP-H組相比無(wú)顯著性差異，可能是由于IL-23是Th17存活、增殖、功能維持的主要因子，并不能促進(jìn)Th17分化，因此在Th17達(dá)到一定量后即維持在此含量，但I(xiàn)L-17A是Th17的效應(yīng)因子，其含量的多少?zèng)Q定下游過(guò)敏效應(yīng)的強(qiáng)弱。綜上，IP-H組的Th17的轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)表達(dá)量高于IG-M組，其致敏效果更好，這也與上述sIgE、Th2型細(xì)胞因子的測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

2.2.7 小鼠脾臟中Treg細(xì)胞比例分析

Treg細(xì)胞是一類調(diào)控機(jī)體免疫功能的細(xì)胞群，能維持免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分的耐受，使機(jī)體保持免疫穩(wěn)態(tài)。Treg細(xì)胞在口服免疫耐受的產(chǎn)生、食物過(guò)敏及其他過(guò)敏性疾病的防治中發(fā)揮了重要的作用，可分為來(lái)源于胸腺的天然型Treg細(xì)胞和胸腺外的誘導(dǎo)型Treg細(xì)胞（induced regulatory T cells，iTreg）兩種類型。口服耐受的形成依賴于iTreg的分化，而iTreg可以在黏膜表面調(diào)節(jié)Th2引起的免疫反應(yīng)[19]。腸道、皮膚、呼吸道和口腔黏膜均可生成功能性Treg細(xì)胞并誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生[30-32]。Treg細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-10、IL-35、TGF-β等免疫抑制因子和/或上調(diào)IL-2受體的表達(dá)抑制其他T細(xì)胞與IL-2受體結(jié)合，從而抑制其他T細(xì)胞的分化與增殖，如抑制抗原特異性Th2的激活，進(jìn)而抑制其介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)[33-36]。由圖10e可知，與對(duì)照組相比，IG-M組的Treg細(xì)胞比例顯著上升，而IP-H組雖有增加，卻無(wú)顯著性，且IG-M組與IP-H組相比也有顯著性上升。Treg細(xì)胞與Th17之間有密切關(guān)系，兩者分化均需要TGF-β，但高濃度的TGF-β會(huì)抑制Th17細(xì)胞分化，且促進(jìn)Treg細(xì)胞分化的IL-2會(huì)抑制Th17細(xì)胞分化，這可能是導(dǎo)致IL-17A mRNA相對(duì)表達(dá)量未上升的原因之一[25,37]。

圖10 兩類致敏模型小鼠脾臟細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例Fig. 10 Ratio between Treg cells and CD4+ cells in spleen cells from two BALB/c mouse models

3 討 論

近10 年，隨著全球?qū)ξr消費(fèi)量的增加，對(duì)蝦過(guò)敏現(xiàn)象日益普遍。研究表明，對(duì)蝦中主要過(guò)敏原TM的氨基酸序列在多類動(dòng)物中具有很高的同源性，高同源性使得TM易發(fā)生交叉反應(yīng)，一些對(duì)蝦過(guò)敏的患者也會(huì)對(duì)環(huán)境中的螨蟲(chóng)、蟑螂等動(dòng)物過(guò)敏，這也是近些年對(duì)蝦過(guò)敏現(xiàn)象劇增的原因之一[3]。因此，針對(duì)TM建立小鼠致敏模型為研究食物過(guò)敏原致敏機(jī)制及其體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)提供了較好的工具，從而為臨床上預(yù)防及治療食物過(guò)敏提供了重要的理論依據(jù)。

本研究通過(guò)臨床過(guò)敏癥狀評(píng)分、TM-sIgE、組胺、Th1及Th2型細(xì)胞因子、Th17型轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對(duì)表達(dá)量等指標(biāo)的測(cè)定，證明腹腔注射TM比口服灌胃更易使小鼠致敏，其Th1/Th2平衡被打破，Th2反應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢(shì)。而根據(jù)TM-sIgG2a、Th1型細(xì)胞因子IFN-γ以及Treg細(xì)胞比例的上升可知，雖有黏膜佐劑的作用，但口服灌胃致敏小鼠仍可能誘導(dǎo)口服免疫耐受的產(chǎn)生，使機(jī)體免疫應(yīng)答偏向Th1型，產(chǎn)生大量無(wú)害的IgG2a。此外，本研究結(jié)果也顯示，TM過(guò)敏受Th1、Th2、Treg、Th17這4 類細(xì)胞相互作用調(diào)控，但其確切的調(diào)控機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。