李 軍，李平蘭，王 順，高 亮，桂 萌,

（1.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100071；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

鱘魚是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)淡水魚，其產(chǎn)量已達(dá)到世界總產(chǎn)量的80%左右。魚類產(chǎn)品具有高水分、高蛋白的特點(diǎn)，極易滋生微生物而腐敗變質(zhì)，不僅造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也為魚類及其產(chǎn)品的流通、貯藏和銷售帶來(lái)不便。目前水產(chǎn)品保鮮技術(shù)主要為冷凍保鮮、化學(xué)保鮮及氣調(diào)保鮮等，但以上方法存在蛋白質(zhì)變性、營(yíng)養(yǎng)成分流失和化學(xué)品殘留等問(wèn)題[1-6]，因此針對(duì)鱘魚及其加工制品安全、高效防腐技術(shù)的研發(fā)成為目前亟待解決的問(wèn)題。

水產(chǎn)品的腐敗主要由微生物引起，因此可以通過(guò)抑制微生物的活性延緩或阻止其生長(zhǎng)，從而對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行防腐保鮮。添加防腐劑是一種方便、有效的食品防腐方法[7-8]。抗菌蛋白（抗菌肽）是植物體內(nèi)一類重要的活性成分，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕鞍拙哂锌咕V廣、高效、環(huán)保、不使病原菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，目前正成為水產(chǎn)品新型防腐劑開發(fā)的研究熱點(diǎn)[9-15]。不同的植物可以產(chǎn)生不同的抗菌蛋白，目前對(duì)于多數(shù)植物抗菌蛋白抑菌特性的研究都集中于病原菌。Mandal等[16]從椰子汁中提取了3 種抗菌蛋白，它們對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有一定的抑制作用。Wong等[17]從青豆中提取了一種抗菌肽，它對(duì)灰霉菌（Botrytis cinerea）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和花生褐斑病菌（Mycosphaerella arachidicola）具有抑制作用。吳海霞[18]利用磷酸鹽緩沖液從銀杏種仁中提取得到抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其對(duì)青霉菌（Penicillium）、產(chǎn)紫青霉（P. purpurogenum）、沙門柏干酪青霉（P. camemberti）和黑曲霉（Aspergillus niger）具有不同程度的抑制作用。付穎穎[19]對(duì)苦瓜蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果表明苦瓜蛋白對(duì)啤酒酵母、紅酵母、黃曲霉和黑曲霉具有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌也具有一定的抑制作用。魚類腐敗菌主要包括氣單胞菌（Aeromonas）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、假單胞菌（Pseudomonas）和希瓦氏菌（Shewanella）等[20-22]，然而目前尚鮮有針對(duì)魚類腐敗菌的植物抗菌蛋白的研究。

植物種子的蛋白含量高、成分復(fù)雜，多種植物種子蛋白具有抑菌活性，如苦豆子種子、苦瓜種子、銀杏種子等[18-19]。根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道，植物種子抗菌蛋白理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，一般易溶于水或有機(jī)溶劑，對(duì)熱處理和酸堿變化穩(wěn)定，且不易被消化酶水解[18-19,23-26]。銀杏種仁抗菌蛋白對(duì)pH值、熱及NaCl溶液較為穩(wěn)定[18]；苦瓜蛋白對(duì)紫外線照射穩(wěn)定，在偏酸性和中性及質(zhì)量濃度低于0.8 mg/mL的NaCl溶液條件下抑菌效果較好[19]。白蘿卜是一種具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蔬菜，同時(shí)也具有促進(jìn)消化、增強(qiáng)食欲、加快胃腸蠕動(dòng)和止咳化痰的作用，在臨床中具有一定的藥用價(jià)值[27-28]。蘿卜抗菌蛋白對(duì)多種植物病原菌的抑菌活性已得到廣泛驗(yàn)證[29-30]，而蘿卜種子蛋白對(duì)魚類腐敗菌的抑菌特性及其理化性質(zhì)的研究還鮮見報(bào)道。

本研究采用硫酸銨沉淀法從白蘿卜籽中提取蛋白，研究了其對(duì)來(lái)源于冷藏鱘魚的28 株腐敗菌的抑菌作用，同時(shí)研究了該蛋白提取物的理化性質(zhì)。本研究為蘿卜籽蛋白提取物作為新型鱘魚防腐劑的開發(fā)和其在水產(chǎn)品防腐保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（E. coli）DH5α（指示菌）購(gòu)于天根生化科技有限公司。受試菌分離于4 ℃冷藏的真空包裝和托盤包裝腐敗鱘魚肉，具體菌種見表1。

LB液體培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基）：酵母膏5 g、蛋白胨10 g和NaCl 10 g。LB固體培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基）：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加17 g瓊脂粉。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（每升培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g和NaCl 5 g。營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加17 g/L瓊脂粉。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；中性蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；KCl、CaCl2、NaCl、MgCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、AlCl3·6H2O、LiCl·H2O、CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、PbCl2、MnSO4·H2O、AgNO3、吐溫20、吐溫-80、司班80 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaOH、HCl 北京化工廠；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 索萊寶生物科技有限公司；β-巰基乙醇 Amerson（中國(guó)）有限公司；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MP5002電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；HWS2型電熱恒溫水浴鍋、LRH生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技儀器有限公司；凱氏定氮儀 濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；HDL潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；微波爐 廣州美的廚房電器制造有限公司；雷磁PHS-3C型pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘿卜籽蛋白的提取及蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

將白蘿卜籽粉碎后與1.5% EDTA緩沖液以料液比1∶5浸泡12 h。8 層紗布過(guò)濾后所得溶液12 000 r/min離心5 min，收集上清液，邊攪拌邊添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的硫酸銨，沉淀3 h，12 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用去離子水復(fù)溶，12 000 r/min離心20 min，上清液即為所需蛋白溶液。將蛋白溶液稀釋100 倍，采用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒（測(cè)定范圍為50～1 000 μg/mL）測(cè)定溶液中蛋白的質(zhì)量濃度。

1.3.2 蘿卜籽蛋白提取物對(duì)鱘魚腐敗菌的抑制作用

選取8 株氣單胞菌、7 株假單胞菌、11 株腸桿菌和2 株其他菌屬的菌株進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。將28 株鱘魚腐敗菌總數(shù)稀釋至106CFU/mL，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，吸取1 mL菌液于培養(yǎng)皿中，加入10 mL融化的營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行混合，待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)皿中心放置滅菌烘干的牛津杯（外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm），用移液槍加入200 μL蛋白溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑。每個(gè)處理組重復(fù)3 次。

1.3.3 溫度對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

取一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液，分別在0、4、25、60、70、80、90、100 ℃水浴30 min。吸取200 μL蛋白溶液，以DH5α為指示菌進(jìn)行牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，以未處理的蛋白溶液作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。相對(duì)抑菌活力按公式（1）計(jì)算。

1.3.4 pH值對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

取一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液，用1 mol/L NaOH和HCl溶液將其pH值分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，37 ℃水浴2 h后將pH值調(diào)至7.0，取200 μL酸、堿處理過(guò)的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進(jìn)行牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，以未處理的蛋白溶液作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。相對(duì)抑菌活力按公式（1）計(jì)算。

1.3.5 紫外線照射時(shí)間對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

取一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液在40 W紫外燈下分別照射（照射距離20 cm）2、4、6、8、10、12 h和24 h。取200 μL處理過(guò)的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進(jìn)行牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，以未處理的蛋白溶液作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。相對(duì)抑菌活力按公式（1）計(jì)算。

1.3.6 金屬離子對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

將K＋、Ca2＋、Na＋、Mg2＋、Fe2＋、Zn2＋、Cu2＋、Al3＋、Li＋、Co2＋、Ni2＋、Pb2＋、Mn2＋和Ag＋添加到一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液中，使金屬離子在溶液中的終濃度分別為10、50 mmol/L和90 mmol/L，37 ℃水浴2 h。取200 μL處理過(guò)的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進(jìn)行牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，以未處理的蛋白溶液作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。相對(duì)抑菌活力按公式（1）計(jì)算。

1.3.7 表面活性劑對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

選取SDS、EDTA、尿素、吐溫20、吐溫-80和司班80 6 種表面活性劑。將6 種表面活性劑添加到一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液中，使表面活性劑的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、5%和10%，37 ℃水浴2 h。取200 μL處理過(guò)的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進(jìn)行牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，以未處理的蛋白溶液作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。相對(duì)抑菌活力按公式（1）計(jì)算。

1.3.8 蛋白酶對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

選取胰蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶4 種蛋白酶，將這4 種蛋白酶分別添加到一定質(zhì)量濃度的蛋白溶液中，使酶的終質(zhì)量濃度分別為l、5 mg/mL和9 mg/mL，37 ℃處理2 h。取200 μL處理過(guò)的蛋白溶液，以DH5α為指示菌進(jìn)行牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)，以未處理的蛋白溶液作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。相對(duì)抑菌活力按公式（1）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜籽蛋白提取物中蛋白質(zhì)量濃度

采用經(jīng)典的Bradford法測(cè)定蛋白溶液中蛋白的質(zhì)量濃度[31]。蘿卜籽蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.360 6x＋0.351 8（R2＝0.991 8）。經(jīng)過(guò)該方法測(cè)定，蘿卜籽蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度為44.56 mg/mL。

2.2 蘿卜籽蛋白提取物對(duì)鱘魚腐敗菌的抑制作用

微生物是導(dǎo)致食品腐敗的主要原因，因此抑制微生物的生長(zhǎng)可以有效地對(duì)食品腐敗進(jìn)行控制。蘿卜籽抗菌蛋白對(duì)28 株鱘魚腐敗菌的抑制作用如表1所示。抗菌蛋白對(duì)所有受試菌株均具有良好的抑制作用。目前對(duì)植物源抗菌蛋白的研究多集中于其對(duì)真菌的抑制作用，對(duì)細(xì)菌抑菌作用的研究較少[18,32-33]。本實(shí)驗(yàn)中的氣單胞菌、腸桿菌和假單胞菌是水產(chǎn)品中常見的腐敗菌[20-22]。結(jié)果表明，蘿卜籽蛋白提取物對(duì)水產(chǎn)品腐敗菌具有廣泛的抑制作用，具有應(yīng)用于水產(chǎn)品防腐的潛力。

表1 蘿卜籽蛋白提取物的抑菌作用Table1 Antimicrobial spectrum of radish seed protein extract

2.3 溫度對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

熱處理是導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的一個(gè)主要原因。其原理是高溫促進(jìn)原子和基團(tuán)的熱運(yùn)動(dòng)，從而使得穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的各種因素減弱、肽鏈松散，使蛋白體系的穩(wěn)定性降低，可溶解的蛋白含量減少，從而發(fā)生蛋白質(zhì)的變性[34]。

表2 溫度對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table2 Effect of temperature on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

從表2中可以看出，蘿卜籽蛋白提取物在0～80 ℃處理?xiàng)l件下其抑菌圈直徑不同程度的減小，但相對(duì)抑菌活力仍大于79.00%。這說(shuō)明抗菌蛋白在低于80 ℃條件下熱穩(wěn)定性較好；溫度高于80 ℃時(shí)，隨著熱處理溫度的提高，蛋白提取物的抑菌圈直徑急劇減小，當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，蛋白提取物相對(duì)抑菌活力僅為22.99%。銀杏種仁抗菌蛋白高于60 ℃處理即發(fā)生顯著變性（幾乎無(wú)抑菌活力），苦瓜抗菌蛋白在64 ℃處理后隨著溫度的上升抑菌活力呈加速下降趨勢(shì)（相對(duì)抑菌活力小于70%）[18-19]。本研究中蘿卜籽蛋白提取物對(duì)溫度的穩(wěn)定性要優(yōu)于銀杏種仁抗菌蛋白和苦瓜抗菌蛋白。

2.4 pH值對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

表3 pH值對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table3 Effect of pH on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)附近易發(fā)生絮凝，導(dǎo)致可溶性蛋白減少，蛋白質(zhì)的生物活性下降。大多數(shù)植物源抗菌蛋白的等電點(diǎn)大于7，銀杏種仁抗菌蛋白和苦瓜抗菌蛋白的等電點(diǎn)分別為8.5和9.6[18-19]。從表3中可以看出，在pH 2.0～8.0范圍內(nèi)蘿卜籽蛋白提取物的相對(duì)抑菌活力大于72.00%，說(shuō)明該蛋白提取物在酸性和偏中性的環(huán)境中穩(wěn)定。在pH值大于8.0時(shí)，蛋白提取物的相對(duì)抑菌活力快速下降，可以推斷蘿卜籽蛋白提取物等電點(diǎn)在8.0～9.0之間。

2.5 紫外線照射時(shí)間對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

有研究報(bào)道苦瓜抗菌蛋白對(duì)紫外線處理穩(wěn)定性較強(qiáng)，芽孢桿菌抗菌脂肽經(jīng)3 h紫外線照射后抑菌活力沒有變化[19,35]。從表4中可以看出，紫外線照射0～24 h，蛋白提取物的抑菌活力仍較好（相對(duì)抑菌活力大于94.00%）。這說(shuō)明紫外線照射時(shí)間對(duì)該蛋白提取物的抑菌活力沒有影響。

表4 紫外線照射對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table4 Effect of ultraviolet irradiation on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.6 金屬離子對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

不同種類、不同濃度的金屬離子均會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，金屬離子對(duì)魚精蛋白的抑菌活力有抑制作用，且電荷數(shù)和濃度越高影響越大（Ca2＋＞Mg2＋＞K＋＞Na＋）[36]。從表5中可以看出，當(dāng)Ag＋濃度為50 mmol/L和90 mmol/L時(shí)，蛋白提取物的相對(duì)抑菌活力下降了約70%，這說(shuō)明Ag＋對(duì)蛋白提取物的抑菌活力有顯著的抑制作用；除Ag＋外，其他13 種金屬離子對(duì)蛋白提取物相對(duì)抑菌活力無(wú)明顯抑制效果（相對(duì)抑菌活力大于90.00%）。金屬離子濃度在90 mmol/L時(shí)，Ni2＋、Cu2＋和Co2＋均可在一定程度上增強(qiáng)蘿卜籽蛋白提取物的抑菌活力（相對(duì)抑菌活力大于110.00%）。

表5 金屬離子對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table5 Effect of metal irons on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.7 表面活性劑對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

食品生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)經(jīng)常使用一些表面活性劑作為乳化劑，如吐溫-80和吐溫20等，因此蛋白提取物對(duì)表面活性劑的穩(wěn)定性可用于評(píng)估其在食品加工過(guò)程中的穩(wěn)定性。如表6所示，蘿卜籽蛋白提取物的抑菌活力因SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而顯著減弱（P＜0.05），說(shuō)明該蛋白提取物對(duì)SDS穩(wěn)定性較差。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的尿素、吐溫20和司班80處理后蛋白提取物相對(duì)抑菌活力均大于90.00%，說(shuō)明該蛋白提取物對(duì)尿素、吐溫20和司班80穩(wěn)定性較好。此外，增大EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以顯著增強(qiáng)蛋白提取物的抑菌活力（P＜0.05）。

表6 表面活性劑對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table6 Effect of surfactants on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

2.8 蛋白酶對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響

如表7所示，蘿卜籽蛋白提取物經(jīng)4 種蛋白酶在不同質(zhì)量濃度分別處理后相對(duì)抑菌活力均大于96.00%，說(shuō)明其對(duì)這4 種蛋白酶的穩(wěn)定性較好，這可能是由于蘿卜籽蛋白的空間構(gòu)象使蛋白酶不易找到酶切位點(diǎn)[35]。不同來(lái)源的抗菌蛋白對(duì)蛋白酶的敏感性不同，芽孢桿菌分泌的抗菌脂肽bacillomycin L對(duì)蛋白酶基本保持穩(wěn)定，芽孢抗菌脂肽經(jīng)1 mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和中性蛋白酶處理2 h后的相對(duì)抑菌活力分別為94.86%、86.21%、96.73%和98.89%[35]。而格氏乳球菌的抗菌蛋白garviecin LG 34極易被蛋白酶水解，該抗菌蛋白分別經(jīng)5 mg/mL木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后完全失去抑菌活力[37]。

表7 不同蛋白酶對(duì)蘿卜籽蛋白提取物抑菌活力的影響Table7 Effect of proteases on bacteriostatic activity of radish seed protein extract

3 結(jié) 論

蘿卜籽蛋白提取物對(duì)來(lái)源于鱘魚的28 株腐敗菌均具有抑制作用：蘿卜籽蛋白提取物對(duì)溫度、酸處理、紫外線穩(wěn)定性較好；對(duì)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和中性蛋白酶均具有較好的穩(wěn)定性（相對(duì)抑菌活力大于96.00%）；對(duì)Ag＋敏感，而對(duì)Pb3＋、Mg2＋、Li＋等13 種金屬離子穩(wěn)定性較好；對(duì)尿素、吐溫20和司班80穩(wěn)定性較好，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA可增強(qiáng)其抑菌活力。以上結(jié)果表明蘿卜籽蛋白提取物對(duì)鱘魚腐敗菌具有廣泛的抑制作用且理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有開發(fā)成新型鱘魚及相關(guān)水產(chǎn)品防腐保鮮劑的潛在價(jià)值。