謝 晶，葉晶鑫，楊勝平，程 穎，林祖權(quán)，錢(qián)韻芳

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對(duì)蝦，是一種高品質(zhì)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類(lèi)品種，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和銷(xiāo)售量在全球許多地區(qū)持續(xù)增加，特別是在中國(guó)和馬來(lái)西亞等地區(qū)[1-2]。但凡納濱對(duì)蝦豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其是較高含量的蛋白質(zhì)，使其在貯藏中極易被微生物分解，降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3-5]。冷藏是延長(zhǎng)食品貨架期最常用的方法，但是仍然有部分微生物能在低溫下生長(zhǎng)，即特定腐敗菌[6-7]，是少數(shù)幾種能夠在一定條件下生長(zhǎng)繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群并代謝產(chǎn)生腐敗產(chǎn)物，最終導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的微生物。水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腐敗菌有希瓦氏菌、假單胞菌、氣單胞菌和不動(dòng)桿菌等。但是水產(chǎn)品中腐敗菌的種類(lèi)和比例受品種、捕獲季節(jié)、貯藏環(huán)境等因素的影響而有較大的差異[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)冷藏凡納濱對(duì)蝦中的特定腐敗菌是腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），它們都是革蘭氏陰性菌，有嗜冷性。S. putrefaciens可以產(chǎn)生大量的三甲胺和腐敗揮發(fā)性物質(zhì)，而P. fluorescens降解蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)[9-10]。近年來(lái)，關(guān)于單一腐敗菌的致腐敗能力的研究比較多，但是在冷藏條件下微生物的生長(zhǎng)和對(duì)食品致腐敗能力與微生物之間的相互作用息息相關(guān)。Mejlholm等[11]在冷藏條件下將肉毒桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）和熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）混合接種至對(duì)蝦上，發(fā)現(xiàn)一些揮發(fā)性腐敗異味只出現(xiàn)在混合接菌組中，Laursen等[12]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)是這兩種菌形成的代謝產(chǎn)物之間的相互作用產(chǎn)生了這種特殊的腐敗異味。因此需要進(jìn)一步研究微生物之間的相互作用對(duì)食品腐敗產(chǎn)生的影響，而且目前關(guān)于S. putrefaciens和P. fluorescens的相互作用對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致腐敗作用的研究較少。

為研究凡納濱對(duì)蝦特定腐敗菌和特定腐敗菌在低溫貯藏下的相互影響，本實(shí)驗(yàn)將S. putrefaciens和P. fluorescens接種到無(wú)菌蝦汁中，以便為開(kāi)發(fā)新型凡納濱對(duì)蝦等水產(chǎn)品的保鮮技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于上海市浦東新區(qū)古棕路農(nóng)工商超市，充氧保活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。立即用碎冰猝死，去頭、去尾、去殼、去腸腺、清洗，用于制備無(wú)菌蝦汁。

鐵瓊脂培養(yǎng)基、假單胞菌選擇性培養(yǎng)基、腦心浸肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；輕質(zhì)氧化鎂、硼酸、鹽酸、檸檬酸鈉、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、丹酰氯、濃氨水、乙腈等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5-型低速離心機(jī) 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；HVE-50滅菌鍋 日本Hirayama制造有限公司；VS-1300L-U超凈工作臺(tái) 上?？蹈Ｌ丨h(huán)境科技有限公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；DHP-9162低溫培養(yǎng)箱 日本三洋電器集團(tuán)有限公司；Kjeltec2300凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；835氨基酸分析儀 日本日立公司；2695高效液相色譜系統(tǒng)、2996二極管陣列檢測(cè)器及Empower色譜管理軟件 美國(guó)Waters有限公司；PowerPac HV Power Supply蛋白電泳分析儀美國(guó)Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

1.3.1.1 S. putrefaciens和P. fluorescens菌懸液的制備

參照Parlapani等[13]的方法略有修改：取1 mL凍存的S. putrefaciens菌液于滅菌的9 mL腦心浸肉湯中活化18 h后，再取1 mL菌液接種于9 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)8 h左右使菌液濃度達(dá)1.0×108CFU/mL后，用于無(wú)菌蝦汁的接種。P. fluorescens菌懸液的制備方法同S. putrefaciens。

1.3.1.2 無(wú)菌蝦汁的制備

參考Fall等[14]的方法制備無(wú)菌蝦汁：鮮活凡納濱對(duì)蝦→去頭、去尾、去殼、去腸腺、清洗→添加2 倍蝦肉的蒸餾水后用榨汁機(jī)攪碎→100 ℃水浴鍋中加熱4 min→冷卻后用紗布過(guò)濾蝦汁→分裝（100 mL/瓶）→添加2.00 g NaCl/瓶→高壓滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min備用

1.3.1.3 接種與貯藏

將滅菌好的蝦汁冷卻至室溫，隨機(jī)分為4 組，其中接菌組每個(gè)錐形瓶中分別加入500 μL S. putrefaciens（S組）或P. fluorescens（P組）菌液，混合接菌組（SP組）分別吸取250 μL兩種菌液加入蝦汁中。以不接菌的蝦汁為對(duì)照組（CK組），然后置于4 ℃恒溫箱中貯藏8 d。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 微生物指標(biāo)的測(cè)定

參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[15]中的平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。用鐵瓊脂、假單胞菌選擇性培養(yǎng)基分別測(cè)單獨(dú)接菌組和混合接菌組中S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落數(shù)，用鐵瓊脂選擇性培養(yǎng)基測(cè)不接菌的蝦汁（CK組）的菌落數(shù)。

1.3.2.2 TVB-N含量的測(cè)定

參照Dabadé等[16]的方法測(cè)定凡納濱對(duì)蝦中的總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，每組樣品做2 個(gè)平行，取平均值。取3.00 mL蝦汁，加入少量的蒸餾水，采用半微量凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.3 氨基酸含量的測(cè)定

氨基酸含量的測(cè)定采用GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[17]所規(guī)定的方法。取200 μL蝦汁放入水解管中水解，再取1.00 mL過(guò)0.22 μm濾膜進(jìn)樣，氨基酸分析儀測(cè)定，每組樣品做2 個(gè)平行。

1.3.2.4 腐胺含量的測(cè)定

凡納濱對(duì)蝦中生物胺的提取參照Ikoni?[18]、Eerola[19]等的方法，然后參照Fan Hongbin等[20]的方法使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行鑒定并定量分析生物胺含量，每組樣品做3 次平行。

1.3.2.5 蝦汁肌漿蛋白SDS-PAGE分析

參考Ramírez-Guerra等[21]的方法提取蝦肉中肌漿蛋白。取蝦汁40 μL，加入100 μL磷酸鹽緩沖液A（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4、pI 0.05、pH 7.5）稀釋。

參考Qian Yunfang等[1]的方法將樣品與上樣緩沖液（2.0 mL 0.5 mol/L Tris-HCl溶液（pH6.8）、4.0 mL 10 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2.0 mL甘油、0.2 mL 1 g/100 mL溴酚藍(lán)、1.8 mL蒸餾水）按體積比1∶1比例混合，在90 ℃條件下加熱9 min；上樣至12%的預(yù)制膠中并在150 V下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）。電泳完成后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色后洗脫并分析。

1.3.2.6 電子鼻檢測(cè)

參考顧賽麒等[22]的方法將新鮮樣品以及貯藏8 d的CK（CK8）、S（S8）、P（P8）、SP（SP8）5 組樣品（每組4 次平行）進(jìn)行電子鼻檢測(cè)。各組于50 ℃平衡400 s后，以潔凈的干燥空氣為載氣，流速150 mL/min，延滯時(shí)間10 min。通過(guò)電子鼻Winmuster分析軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.6軟件繪制曲線；采用SPSS 19軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦汁中菌落數(shù)的影響

圖1 接菌蝦汁在4 ℃貯藏7 d菌落數(shù)的變化Fig. 1 Synergistic growth of S. putrefaciens and P. fluorescens in shrimp juice during storage at 4 ℃ for 7 days

圖1 為在4 ℃條件下的凡納濱對(duì)蝦蝦汁中S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落數(shù)變化趨勢(shì)圖。初始接菌量約為5.30（lg（CFU/mL））。從圖1中可以看出，單獨(dú)接種S. putrefaciens的菌落數(shù)始終高于P組，且呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），從2 d開(kāi)始，單獨(dú)接種S. putrefaciens的菌落數(shù)就已經(jīng)達(dá)到7.08（lg（CFU/mL）），說(shuō)明在4 ℃冷藏凡納濱對(duì)蝦蝦汁中S. putrefaciens的生長(zhǎng)繁殖能力高于P. fluorescens，與前期研究發(fā)現(xiàn)冷藏凡納濱對(duì)蝦菌群中S. putrefaciens的相對(duì)豐度高于P. fluorescens[23]相一致。SP組中的S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落數(shù)在貯藏7 d后分別達(dá)到8.85（lg（CFU/mL））和8.26（lg（CFU/mL）），都顯著高于單獨(dú)接菌組（P＜0.05），表明這兩種微生物存在相互促進(jìn)作用。Joffraud等[24]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）和弧菌（Vibrio sp.）可以縮短棲魚(yú)肉食桿菌（Carnobacterium piscicola）的延滯期，Laursen等[12]發(fā)現(xiàn)肉食桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）可以促進(jìn)熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）的生長(zhǎng)。

2.2 不同處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦汁中TVB-N含量的影響

圖2 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中TVB-N含量的變化Fig. 2 TVB-N contents of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

在微生物和酶的共同作用下，水產(chǎn)品中含量較高的蛋白質(zhì)被分解而產(chǎn)生的氨以及胺類(lèi)等含氮物質(zhì)統(tǒng)稱為T(mén)VB-N[25]。TVB-N是評(píng)判水產(chǎn)品的鮮度和微生物引起水產(chǎn)品腐敗程度的重要指標(biāo)[26]，由圖2可知，3 組接菌組的TVB-N含量上升較快，與CK組有顯著性差異，表明接菌組TVB-N含量的上升與其接種的微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)有關(guān)，CK組因經(jīng)過(guò)高溫滅菌微生物數(shù)量較少，因此TVB-N含量上升緩慢。在接菌的初期TVB-N含量升高緩慢，2 d后迅速上升，說(shuō)明微生物數(shù)量達(dá)到一定數(shù)量后，腐敗產(chǎn)物才會(huì)進(jìn)入快速形成階段。P組的TVB-N含量較S組低，說(shuō)明S. putrefaciens對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致腐敗能力比P. fluorescens強(qiáng)，這與圖1中菌落數(shù)的變化一致。SP組的TVB-N含量在貯藏7 d后達(dá)到16.19 mg/100 mL，較單獨(dú)接菌組高，說(shuō)明這兩種腐敗菌具有協(xié)同作用，其致腐敗能力高于單獨(dú)接菌組；這可能是因?yàn)檫@兩種腐敗菌可分泌促進(jìn)雙方生長(zhǎng)的信號(hào)分子[27]。

2.3 不同處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦汁中氨基酸含量的影響

表1 接菌蝦汁在4 ℃貯藏8 d后氨基酸含量的變化Table1 Total amino acid contents of uninoculated and inoculated Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃ for 8 days mg/g

有機(jī)體蛋白質(zhì)組織的基本成分是氨基酸，其在生物體的生命活動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的作用[28-29]。從表1中可以看出，與新鮮樣品對(duì)比，貯藏終點(diǎn)的接菌組中各種氨基酸的含量降低。貯藏8 d后，S組中Asp、Ala、Leu和His等各氨基酸和總氨基酸的含量均低于P組，但高于SP組，說(shuō)明在4 ℃貯藏中S. putrefaciens的氨基酸降解能力高于P. fluorescens，而二者可協(xié)同加速氨基酸的降解。

2.4 不同處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦汁中生物胺含量的影響

圖3 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中腐胺含量的變化Fig. 3 Putrescine contents of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

S. putrefaciens和P. fluorescens可以使高蛋白水產(chǎn)品中鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸和組氨酸發(fā)生脫羧作用生成腐胺、尸胺和少量組胺，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物產(chǎn)生的生物胺的含量升高，有害物質(zhì)積累，水產(chǎn)品的新鮮程度逐漸降低。腐胺是凡納濱對(duì)蝦腐敗過(guò)程中最主要的生物胺[30-31]。從圖3可看出，CK組的腐胺含量幾乎沒(méi)有上升，而且在任何時(shí)間段，S組的腐胺含量都比P組高，說(shuō)明在4 ℃貯藏下S. putrefaciens的致腐敗能力強(qiáng)于P. fluorescens。SP組在2 d后腐胺含量迅速上升，高于單獨(dú)接菌組，在4 d時(shí)SP組的腐胺含量為50.43 mg/100 mL，比S組的含量高45.46%；說(shuō)明S. putrefaciens和P. fluorescens在蝦汁中的協(xié)同作用會(huì)促進(jìn)微生物代謝產(chǎn)生脫羧酶，形成生物胺，提高對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致腐敗能力。在4～6 d時(shí)，3 個(gè)接菌組的腐胺含量略有下降，這可能是因?yàn)榈蜏丨h(huán)境下微生物進(jìn)入穩(wěn)定期后，代謝活性降低，同時(shí)腐胺也有可能被分解，這與孫亞軍[32]的研究結(jié)果一致。

2.5 不同處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦汁中肌漿蛋白的影響

圖4 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中肌漿蛋白的變化Fig. 4 SDS-PAGE pattern of myogens in Pacific white shrimp during storage at 4 ℃

圖4 是通過(guò)SDS-PAGE法分析了4 ℃貯藏3 d和7 d時(shí)，3 種接菌方式對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌漿蛋白的影響。可以看出，凡納濱對(duì)蝦蝦汁在4 ℃貯藏3 d和7 d后，相比于S組和P組，SP組的蛋白條帶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的灰度略有降低，說(shuō)明混合接菌處理加速了對(duì)肌漿蛋白的降解，對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦汁的致腐敗能力較強(qiáng)。

2.6 不同處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦蝦汁中揮發(fā)性氣味的影響

圖5 接菌蝦汁在4 ℃貯藏中香氣輪廓PCA圖Fig. 5 PCA chart for aroma profiles of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

主成分分析（principal component analysis，PCA）可以根據(jù)不同接菌組產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的相似性和差異性將復(fù)雜的信息更加直觀地展現(xiàn)出來(lái)[33-34]。食品中微生物的迅速繁殖導(dǎo)致了腐敗代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，包括感官不可接受的腐敗揮發(fā)性物質(zhì)。由圖5可知，各組數(shù)據(jù)采集點(diǎn)所在的區(qū)域無(wú)重疊，說(shuō)明主成分分析法適用于不同接菌組中揮發(fā)性物質(zhì)的分析。第一主成分的貢獻(xiàn)率為97.43%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為1.62%，兩者的總貢獻(xiàn)率為99.05%，說(shuō)明所受干擾較小，可以將不同接菌組的腐敗情況完全區(qū)分開(kāi)。貯藏8 d后的CK組和P組，與貯藏8 d后的SP組和S組在PC1軸差異較大，表明電子鼻區(qū)分以上組別主要是第一主成分起作用。接菌組中與新鮮樣品差異最大的是貯藏8 d的S組，其次是SP組，與新鮮樣品差異最小的單獨(dú)接種組是P. fluorescens組，說(shuō)明S. putrefaciens在4 ℃貯藏8 d后產(chǎn)生的腐敗揮發(fā)性物質(zhì)的能力最強(qiáng)，在S. putrefaciens存在的條件下可以加速P. fluorescens產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物，提高其腐敗活性，與Mejlholm等[11]的研究結(jié)果一致。兩種菌在混合培養(yǎng)的條件下才會(huì)產(chǎn)生某種腐敗揮發(fā)性物質(zhì)，可能是這兩種菌形成的代謝產(chǎn)物之間的相互作用所致[12]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了凡納濱對(duì)蝦中的主要腐敗微生物S. putrefaciens和P. fluorescens之間的相互作用。通過(guò)菌落數(shù)分析發(fā)現(xiàn)S. putrefaciens比P. fluorescens更適應(yīng)于在4 ℃的蝦汁中生長(zhǎng)。相比于單獨(dú)接菌組，混合接菌組中的TVB-N含量和腐胺含量更高，說(shuō)明兩種菌混合培養(yǎng)能相互提高彼此的致腐敗能力。本研究有助于加深對(duì)水產(chǎn)品復(fù)雜菌群體系中微生物相互作用方式的了解，為開(kāi)發(fā)新型凡納濱對(duì)蝦等水產(chǎn)品的保鮮技術(shù)提供了一定的理論依據(jù)。